[发明专利]一种基因工程菌及其在催化二腈选择性水解中的应用

说明书

本发明提供了一种基因工程菌及其在催化二腈选择性水解中的应用。本发明公开的基因工程菌携带含有两段腈水解酶nh基因的重组表达载体，能够实现腈水解酶的双表达，催化二腈水解活力和选择性高，转化率可达99%以上。由于实现了腈水解酶的双表达，导致酶的生产成本低，并且该制备条件温和、无需添加大量有机溶剂，有利于进一步的工业化生产，在抗癫痫药物加巴喷丁的生产中具有很好的工业开发前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种能够实现腈水解酶双表达的基因工程菌，该重组基因工程菌的培养方法，和该重组菌作为催化剂在选择性水解二腈以制备加巴喷丁中间体中的应用。

背景技术

加巴喷丁(Gabapentin),化学名为1-氨甲基-1-环己烷乙酸，CAS号为60142-96-3。它是美国Warner-Lambert公司首先开发的抗癫痛药(商品名为Neurotin)，于1993年首次在英国上市，之后，相继在美国、加拿大、法国、德国、意大利、日本等世界上多数国家上市。随着临床应用上的拓展，加巴喷丁的销售迅速增长，1997年的销售额为3.74亿美元，1999年的销售额为9.1亿美元，2002年为22.7亿美元，2005年达到近30亿美元，在全球80亿美元的抗癫痫药市场中占有很大份额。2005年，加巴喷丁进入世界畅销药物100强的行列。被医疗界列为畅销药物中的“重磅炸弹”。已成为世界上最常用的抗癫痛药之一。随着加巴喷丁治疗适应症的不断扩大，其原料药的需求也在逐年增加。

通过二腈底物(1)区域选择性水解合成1-氰基环己乙酸(2)，进而催化加氢还原其为最终产物加巴喷丁(3)是一条绿色的制备途径(图3所示)。但是，催化二腈(1)区域选择性水解的催化剂不多，大部分化学催化剂存在区域选择性差，产物1-氰基环己乙酸中有一定量的二酸存在，增加了后续产物分离的难度和成本。此外，还存在反应条件苛刻、环保性差等问题。

生物催化具有反应条件温和、高活性和高选择性等优势，广泛用于实验室研究和医药化学制造领域。腈水解酶是研究较早的一类生物催化剂，能够催化腈类底物水解生成羧酸类产物，在工业生产中有一定的应用。瑞士龙沙公司就发现一种新的菌株，可用于5-羟基-吡嗪-2-甲酸及5-羟基-毗啶-2-甲酸的生产，两者均是药物的关键中间体，转化率几乎是100％[Stepanek F,ChemEngSci,1999,54:1493-1498]。杜邦公司利用Acidovoraxfacilis 72W催化2-甲基戊二腈生成4-氰基戊酸，后者是生产1,5-二甲基-2-哌啶酮的重要中间体[Cooling FB,J MolCatal.B:Enzym,2001,11:295-306]。薛建萍等人筛选乳酪短杆菌(Brevibacteriumcasei CGMCC No.0887)，通过长期的诱变育种，使得这种乳酪短杆菌每毫升发酵液中腈酶活力单位可以达到10万之多，羟基乙酸的年产量达到150t[薛建萍,生物催化生产羟基乙酸,中国专利,1772912A.2006.05.17.]。

腈水解酶催化反应的高度化学、区域和立体选择性也被广为报道[Rey P.,J.Agric.Food Chem.2004,52:8155-8162；Chauhan S.,Appl.Microbiol.Biotechnol.2003,61:118-122]。区域选择性的腈水解酶能够选择性水解二腈中的一个氰基，将其转化成单氰基羧酸，这是化学方法难以实现的。1988年，日本科学家首次对来自于Rhodococcus rhodochrous J1中的腈酶的区域选择性进行报道，以1,3-二氰基苯和1,4-二氰基苯作为底物时，该酶只作用于一个氰基，生成相应的单氰基羧酸[Kobayashi M.,Appl.Microbiol.Biotechnol.1988,29:231-233；Kobayashi M,J BiolChem.1992,267:20746-20751]。后续又有来自于RhodococcusrhodochrousLL100-21，Rhodococcus.sp等菌株的腈水解酶被报道具有区域选择性。