[发明专利]一种延长烟用浆果类提取物货架期的抗菌剂筛选方法

权利要求书

1.一种延长烟用浆果类提取物货架期的抗菌剂筛选方法，其特征在于具体包括以下步骤：

(1)污染微生物培养和分离：称取1g烟用浆果类提取物污染样品加入99mL无菌生理盐水中，置于摇床上150r/min震荡10～15min,然后将悬浮液用无菌生理盐水稀释到10^-7～10^-5，并取出100μL均匀涂布在Waksman培养基上，将培养物放入30℃恒温培养箱内培养20～25h；

(2)污染微生物鉴定：将步骤(1)中培养好的污染微生物用接种环挑取单菌落，经过涂片和1％蕃红染色后再进行显微镜观察，根据菌落形态和显微特征判断污染微生物种类；并在显微镜检的基础上，通过Biolog微生物自动分析系统鉴定污染微生物种名和属名；

(3)抑菌试验：根据步骤(2)中判断的污染微生物种类，每个种类选用多种食品级抗菌剂，用灭菌吐温80溶液配制成体积分数为1％的母液，然后采用7次二倍稀释法形成不同梯度浓度的抗菌液；用灭菌接种环挑取步骤(1)中培养好的污染微生物单个菌落，分别接种于Waksman液体培养基30℃恒温培养箱中培养2～4h，然后采用可见分光光度法测定菌悬液浓度，OD_600nm在0.4～0.5时备用；用移液器在96孔板中分别加入0.9ml的Waksman液体培养基，按照不同梯度浓度分别加入0.1ml抗菌液，以加入0.1ml的吐温80溶液为阳性对照，混合均匀后接种20μL菌悬液，将孔板置于30℃，100rpm条件下培养24h，观察抑菌效果，选择出对每种污染微生物抑菌效果最显著的抗菌剂；当步骤(2)中的测定的污染微生物种类为一种时，其选择出来的抗菌剂即为该烟用浆果类提取物的抗菌剂；当步骤(2)中测定的污染微生物种类等于或大于两种时，将两种或两种以上的抗菌剂进行复配得到该烟用浆果类提取物的抗菌剂；

(4)最低抑菌浓度的测定：把步骤(3)中抑菌试验中7个稀释浓度和对照进行编号，依次为X₁、X₂……X₈，将样品摇匀后在吸收波长600nm处用可见分光光度计测定光密度值，当X_n-X_n-1/X_n取最大值时，X_n-1对应的浓度为该抑菌剂的最低抑菌浓度即该抗菌剂的最小添加量。

2.根据权利要求1所述的一种延长烟用浆果类提取物货架期的抗菌剂筛选方法，其特征在于：所述步骤(1)中烟用浆果类提取物的污染样品为出现浑浊和胀气的樱桃提取物、杏子汁或葡萄提取物中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的一种延长烟用浆果类提取物货架期的抗菌剂筛选方法，其特征在于：所述步骤(2)中Biolog微生物自动分析具体是采用灭菌棉签挑取步骤(1)中已经培养好的污染微生物菌落，在无菌状态下接种到浊度管中，并用空白调至100％,用标准液管调到指定刻度，再用接种后的浊度管进行测量，用无菌水不断调整浊度的大小，达到以上标准浊度值，然后将制备好的菌悬液倒人加样槽中，使用八道电动移液器，将其接种于微平板的96孔中，微平板在28℃生化培养箱中，在培养第6h和第24h后，将微平板放入读数仪测定反应结果，从Microlog软件结果分析得出污染微生物的种名和属名。

4.根据权利要求1所述的一种延长烟用浆果类提取物货架期的抗菌剂筛选方法，其特征在于所述步骤(1)和步骤(3)中Waksman培养基配方(g/L)为：葡萄糖10.0，蛋白胨5.0，氯化钠5.0，牛肉膏3.0，琼脂18.0，pH 6.8。

5.根据权利要求1所述的一种延长烟用浆果类提取物货架期的抗菌剂筛选方法，其特征在于：所述步骤(1)中的无菌生理盐水中NaCl浓度为0.85％。

6.根据权利要求2所述的一种延长烟用浆果类提取物货架期的抗菌剂筛选方法，其特征在于：当步骤(1)中烟用浆果类提取物为樱桃提取物时，其步骤(2)中鉴定的污染微生物主要是酵母和芽胞杆菌类，步骤(3)中的抗菌剂是由乳酸链球菌素和脱氢乙酸钠按照质量比3:1的比例复配而成，其添加量为10～50ppm。