[发明专利]一种拯救麻疹Schwarz/Moraten疫苗株的系统和方法

说明书

本发明提供了一种麻疹Schwarz/Moraten疫苗株反向遗传学方法，包括如下步骤：(1)病毒全长质粒pT7MV_sw和辅助质粒与哺乳动物细胞混合；(2)电击转染；(3)培养细胞，收获病毒；所述全长质粒包含T7启动子和麻疹Schwarz/Moraten疫苗株基因组或反基因组序列；所述辅助质粒包括pT7‑SWN(带有T7启动子和麻疹N蛋白编码序列)、pT7‑SWP(带有T7启动子和麻疹P蛋白编码序列)、pT7‑SWL(带有T7启动子和麻疹L蛋白编码序列)、pT7‑T7RNAP(带有T7启动子和T7RNA聚合酶编码序列)、pCDIBP‑T7RNAP(带有CMV启动子和T7RNA聚合酶编码序列)。本发明能成功拯救出麻疹Schwarz/Moraten疫苗株，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及病毒反向遗传学领域，特别涉及一种麻疹Schwarz/Moraten疫苗株的拯救系统和方法。

背景技术

麻疹病毒(Measlesvirus,Mev)属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)，基因组全长为15894个核苷酸[1]。1954年Enders和Peebles 在人、猴肾细胞培养物上分离成功第一株麻疹病毒野毒株Edmonston，并在组织培养物中连续传代[2]。由于麻疹具有极强的感染性，因此在接触前接种麻疹疫苗是控制麻疹唯一合理的方法。

Edmonston野毒株是当前世界上广泛使用的麻疹减毒疫苗株的来源株，例如AIK-C，Zagreb，Schwarz以及Moraten疫苗株[3]。Edmonston野毒株在人肾细胞、羊膜细胞、鸡胚细胞上传代适应，因传代次数不同产生两种麻疹减毒株Edmonston A和B。1963年，默克公司上市销售全球第一个麻疹疫苗 Edmonston B株，该疫苗于1975年退市。减毒株Edmonston A和B分别在鸡胚细胞上继续传代及鸡胚细胞上低温传代适应获得更为减毒的Schwarz和Moraten疫苗株。GSK公司麻腮风水痘四联苗中的麻疹疫苗株Schwarz共传156 代，默克公司麻腮风水痘四联苗中的麻疹疫苗株Moraten共传128代，研究表明，两个疫苗株序列在核苷酸及蛋白质水平完全一致[4]。目前， Schwarz/Moraten疫苗株是世界范围内最广泛使用的麻疹疫苗株[5]。

为了获得性状稳定的疫苗，通常采取反向遗传学的方法制备减毒活病毒。该方法通常将病毒株全长cDNA与编码蛋白N、P、L的基因克隆在T7启动子控制的质粒上，将全长质粒及辅助质粒共转染宿主细胞，质粒需在T7RNA 聚合酶的作用下进行转录完成病毒的拯救。T7RNA聚合酶通常通过转染可表达T7RNA聚合酶的重组痘病毒或能稳定表达T7RNA聚合酶的工程化细胞提供。

将重组痘病毒转入T7RNA聚合酶获得的工程化细胞用于疫苗生产，后期纯化时无法彻底去除重组痘病毒，无法满足GMP对病毒候选疫苗临床应用的要求，因此采用该方法拯救所得病毒不能用于疫苗的开发和生产。

可持续表达T7RNA聚合酶的工程化细胞拯救重组病毒无需引入重组痘病毒，但在使用过程中也受到一定的限制。一方面，构建并维持能稳定表达 T7RNA聚合酶工程细胞存在一定的难度；另一方面，构建所得的工程化细胞基因组序列在原有细胞基础上有插入，为保证疫苗临床应用的安全性，将工程化细胞应用到疫苗的开发、生产过程中需要经过验证，验证工程化细胞并将其用于疫苗的生产难度较大。因此，对于需要在人类身上进行临床试验进行评估的候选疫苗的开发，在其病毒株的生产过程中使用能表达T7RNA聚合酶的病毒或工程化细胞，都会使得整个疫苗从开发到临床应用过程复杂化，加大批准难度。

综上，使用常规的病毒拯救体系无法满足麻疹Schwarz/Moraten株疫苗开发的需求。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种麻疹Schwarz/Moraten疫苗株拯救系统和拯救方法。