[发明专利]整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法及应用

权利要求书

1.整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株，其特征在于，该益生菌克隆株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018.7.2，保藏编号为CGMCCNo.16046。

2.根据权利要求1所述的整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）pTargetT-nth/tppB::P_tetF4重组质粒的构建：

利用pB032-nth/tppB/pB033扩增引物从pTargetF质粒DNA模板中反向PCR扩增含有靶标位点nth/tppB的 N20序列的pTargetF-nth/tppB线性化片段，随后对所得的线性化片段环化得到第一环化产物，第一环化产物转化入感受态细胞DH5α 中以构建pTargetT-nth/tppB重组质粒； nth/tppB upsteamHA-F/ nth/tppB upsteamHA-R 和 nth/tppBdownsteamHA-F/ nth/tppB downsteamHA-R扩增引物用来从Nissle1917基因组模板中扩增靶标位点的上游同源臂和下游同源臂；ptetFWD/ ptetF4REV-nth/tppB 扩增引物用于从pBR322-F4 DNA模板中扩增带有P_tet 启动子的F4菌毛操纵子基因；IPCRpTargetF-F/IPCRpTargetF-R用来线性化pTargetT-nth/tppB质粒；使用ClonExpress^® MultiS一步克隆试剂盒将靶标位点上下游同源臂、含P_tet启动子的F4菌毛操纵子基因片段、线性化的pTargetT-nth/tppB片段一起环化得到第二环化产物；第二环化产物随后转化进感受态细胞DH5α中以构建pTargetT-nth/tppB::P_tetF4系列重组质粒，nth/tppB为EcNc染色体上特定基因的靶标位点；第二环化产物中，环化连接排列的顺序为：靶标位点上游同源臂片段、含P_tet启动子的F4菌毛操纵子基因片段、靶标位点下游同源臂片段、线性化的pTargetT-nth/tppB片段；

pB032-nth/tppB扩增引物序列为：AGTCCTAGGTATAATACTAGTatattactggaacaacataaGTTTTAGAGCTAGAAATAG；

pB033扩增引物序列为：ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAG；

含有靶标位点nth/tppB的 N20序列为：ATATTACTGGAACAACATAA；

nth/tppB upsteamHA-F扩增引物序列为：ttctctagagtcgacctgcagTTCGCCGCCAAAAAAGGTCCG；

nth/tppB upsteamHA-R扩增引物序列为：ataatggtttcttagacgtcTTCGCCGTCGCCTTATTAACA；

nth/tppB downsteamHA-F扩增引物序列为：AACACTGCATTCGGCTGGCCG；

nth/tppB downsteamHA-R扩增引物序列为：cagggtaatagatctaagcttCGTGTGTAAATTTAAATGATT；

ptetFWD扩增引物为：gacgtctaagaaaccattattatca；

ptetF4REV-nth/tppB 扩增引物为： GGCCAGCCGAATGCAGTGTTtcagaaatacaccaccaccggtgtc；

IPCRpTargetF-F序列为：AAGCTTAGATCTATTACCCTGT；

IPCRpTargetF-R序列为：CTGCAGGTCGACTCTAGAGAA；

2）通过整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因表达展示在益生菌克隆株菌体表面，得到无抗性的单拷贝F4菌毛基因整合克隆株。