[发明专利]整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法及应用

说明书

本发明涉及到生物技术领域，具体涉及整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法及应用，包括如下步骤：pTargetT‑nth/tppB::P_tetF4重组质粒的构建；通过整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株的构建，得到无抗性的单拷贝F4菌毛基因整合克隆株。该益生菌克隆株作为益生菌活疫苗候选株和仔猪断奶后腹泻和水肿病的治疗用药物。相对于现有技术，本发明的有益效果为：去除Nissle1917益生菌原有质粒，无抗性基因的存在；该重组菌能够有效提高对猪肠道传代上皮细胞的粘附性能；口服免疫小鼠能产生免疫血清，即抗F4菌毛的IgG的抗体；口服免疫后小鼠的血清能显著减低F4⁺菌株对猪肠道传代细胞系的粘附。

技术领域

本发明涉及到生物技术应用领域，具体涉及到细菌的染色体整合、稳定遗传表达展示外源功能性F4菌毛蛋白。

背景技术

大肠杆菌Nissle1917是一株无致病性的益生菌，至今并未发现对宿主有已知的不益影响，能给予不同宿主健康益处，且该菌株作为在欧洲上市的名为Mutaflor益生菌产品的主要活性成分，主要用于人类肠道健康调节。在临床应用上，益生菌Nissle1917菌株作为基因工程的载体被加以改造，该益生菌已用于疫苗，肿瘤治疗，保健品，诊断制剂等方面产品的开发与研制。EcNc克隆株为大肠杆菌Nissle1917原型野生株基因改造去除其胞内两个隐秘性质粒pMUT1和pMUT2，具备比亲本株携带更多(大)容量的同源或外源基因的特性，已在申请人实验室制备获得。

为了实现微生物中同源或异源蛋白或化合物的过量表达生产，大多利用质粒的过表达，鉴于这种方法易于操作和调控的表达而被广泛使用，但这种方法存在遗传不稳定性。质粒的复制，携带抗生素抗性基因，过量表达以及其他异源基因等问题所带来的代谢负担会导致宿主细胞耗竭，产量损失甚至导致宿主细胞原始功能丧失。此外，为了维持细菌细胞中质粒的存在，须使用抗生素或其他选择性药剂，从而增加了整个生物加工的成本，同时也增加了耐药基因传播的几率。近年来，细菌染色体表达同源或异源基因在合成生物学和生物医学中越来越受青睐。

在细菌染色体组整合同源或外源的DNA基因分子，常用的分子生物学方法包括使用转座子、噬菌体、核酸内切酶和重组酶系统，常规的分子生物学方法在细菌染色体整合基因上具有一定的优势，但也都存在着自身的局限性，如长片段基因难以整合，效率低，脱靶率高等。本申请专利所使用的方法为CRISPR/cas9双质粒系统对益生菌Nissle1917无质粒克隆株染色体进行外源大片段DNA基因片段(F4菌毛操纵子基因长约8Kb)的整合。

断奶仔猪腹泻(PWD)和仔猪水肿病(ED)为养猪业临床上常见的疾病，主要病原菌为F4和F18菌毛阳性产肠毒素大肠杆菌ETEC，通过菌毛黏附、定植易感仔猪后感染发病，导致仔猪高死亡率，体重降低，生长缓慢，药物治疗费用昂贵等。临床上防治该疾病主要运用抗生素治疗，但随着养殖业生产上耐药菌的产生和累积，急需研究新的防控措施。本专利所构建的多功效益生菌Nissle1917无质粒克隆菌EcNc稳定携带遗传表面表达展示功能性F4菌毛，有望为断奶仔猪腹泻的防控提供新思路和策略。

发明内容

为了克服上述缺陷，本专利申请为利用益生菌Nissle1917无质粒克隆菌EcNc菌株染色体中非必需基因nth/tppB位点单拷贝整合并稳定表达F4(K88)菌毛，有望作为由F4⁺菌株引起的抗仔猪断奶后腹泻益生菌活性疫苗候选株。

为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株，该益生菌克隆株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018.7.2，保藏编号为CGMCC No.16046。

整合单拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：