[发明专利]一种低丰度蛋白质翻译后修饰组的直接质谱检测方法

权利要求书

1.一种低丰度蛋白质翻译后修饰组的直接质谱检测方法，其特征在于：利用模拟靶向蛋白质组学技术进行低丰度蛋白质、多肽及其翻译后修饰肽段直接检测方法，其特征在于：

(1)目标肽段靶标清单的构建：利用数据依赖的质谱扫描模式，进行蛋白酶解样品中酶解肽段的数据采集，通过蛋白质组学搜库软件检索，获得一系列带有打分值的多肽鉴定结果；根据打分值，将肽段划分为高低两个可信区间选取低可信区间中低丰度肽段和发生翻译后修饰的肽段，构建目标肽段靶标清单；

(2)目标肽段靶标清单的鉴定：利用质谱的靶向识别功能，特异性地针对目标肽段靶标清单中的肽段进行碎裂及后续扫描，从而使清单中的蛋白质酶解多肽、翻译后修饰肽能够被碎裂及扫描，因此能够有效避免高丰度非目标肽段的干扰；通过这种方法获取高质量的肽段谱图，并使用蛋白质组学搜库软件检索，从而显著地提高样品中低丰度肽段、翻译后修饰肽段的鉴定可信度和鉴定数目。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(1)过程：

1)蛋白质样品进行蛋白质原位酶解(包括但不局限于胰酶、胃酶等中的一种或二种以上)消化后，经过除盐、冻干样品预处理步骤；

2)将酶解样品进行数据依赖模式的质谱扫描，使用样品来源物种的蛋白质组数据库作为背景蛋白数据库，使用蛋白质组鉴定软件(如MASCOT)搜库检索，将鉴定到的所有蛋白作为一个新的背景蛋白数据库，重新使用这个新库作为背景蛋白数据库进行软件搜库；

3)选取低可信区间中低丰度肽段和发生翻译后修饰的肽段，构建目标肽段靶标清单；根据搜库结果，将鉴定结果分为高低两个可信度区间；可信区间的划分可以根据实际样品的需求进行调整；搜库软件给出的肽段匹配到碎片离子个数少于5个时可被认为是低丰度肽段，翻译后修饰肽段发生修饰化位点处的碎片离子缺失鉴定时可被认为低可信的翻译后修饰肽段，包括以上情况中的一种或二种以上的肽段都可以划分至低可信区间；提取低可信区间内肽段的保留时间、质量、电荷数、序列信息等，构建包含低可信区域肽段的靶标清单，用于后续的靶向确认。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(2)过程：

1)将构建目标肽段靶标清单导入到质谱仪器采集方法中，建立含有预设靶标肽段清单的的平行反应监测采集方法；经色谱分离的酶解肽段样品在质谱中由预设的平行反应监测方法进行一站式的筛选、累积、碎裂、采集等分析步骤；

当质谱在一级谱全扫中扫描到符合预设靶标清单中信息的肽段母离子时，将在四级杆中累积这些符合条件的肽段母离子，随后目标肽段将被送往碰撞池进行碎裂后，再送往静电场轨道阱进行高分辨扫描并采集相应的碎片离子二级谱；

2)采集到的谱图再次经过蛋白质组学搜库软件检索得到肽段鉴定结果，避免高丰度蛋白质酶解肽段的干扰，提高目标肽段在质谱中的累积时间，从而特异性地筛选、富集、鉴定预设靶标清单中的低可信肽段，提高低丰度肽段、翻译后修饰肽段的鉴定灵敏度或鉴定效率。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述低丰度肽段包括但不限于肽段物质的量低于0.1皮摩尔、肽段离子化效率低于50％、肽段碎裂效率低于50％等情况中的一种或二种以上；

所述翻译后修饰肽段来源包括但不仅限于肽段上发生磷酸化、甲基化、乙酰化修饰等翻译后修饰中的一种或二种以上；

上述肽段在复杂蛋白质组样品中相对丰度较低导致质谱信号弱，通过普通方法鉴定的结果很可能因受到高丰度蛋白质的干扰导致鉴定结果较差，可信度低；因此常规的蛋白质组学方法无法实现其高灵敏度、高可信度检测；

所述的蛋白质组鉴定软件包括但不限于MASCOT，ProteinDiscoverer，MaxQuant，Pfind等软件中的一种或两种以上。