[发明专利]一种酪氨酸酶前体与编码基因及其制备与应用

说明书

本发明公开了一种来源于奥氏蜜环菌(Armillaria ostoyae)的酪氨酸酶前体基因及其酶的制备方法与应用，即利用基因工程的技术方法，将该酪氨酸酶前体的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，该菌株异源表达制备的酪氨酸酶前体，经胰蛋白酶活化后能高效催化单酚和邻双酚类化合物，其催化单酚和双酚的能力分别是商业化酪氨酸酶的6倍和3倍。具有高的pH稳定性和较高的温度稳定性。此外此酪氨酸酶前体也可由SDS激发活性，调控反应的起始，并可由不同浓度的SDS调控酶活力。本发明提供的酪氨酸酶前体可广泛应用于有机合成、废水处理、医疗美容等领域。

技术领域

本发明涉及一种酪氨酸酶前体的基因序列及其制备方法和应用。本发明提供了该酪氨酸酶前体的重组质粒和重组基因工程菌株及其在催化酚类化合物方面的应用。本发明提供的酪氨酸酶前体可广泛应用于有机合成、废水处理、医疗美容等领域。

背景技术

苯醌类化合物是指某些分子中存在环状不饱和二酮(即环己二烯二酮)结构的，具备较大共轭体系的化合物，在我们生活的大自然中苯醌类化合物普遍存在,并在很多重要的化学和生物转换过程中发挥重要作用。邻苯二酚衍生物和苯醌类化合物一样都是具有较好应用前景的化工原料，也是工业合成有机物的主要原料，常用于一些行业所需中间体的合成，如染料制造、医学制造、阻燃剂以及橡胶防老剂的生产等。

目前苯醌类化合物和邻苯二酚衍生物都是用化学方法进行生产，其合成方法较多，存在副产物多，污染严重，转化率低、反应条件苛刻、成本高问题。生物催化方法避免了化学方法的缺点，反应条件温和易控，能达到绿色化学的现代理念。与化学方法以及非生物催化剂相比，生物催化剂具有很大的优势，能在常温下反应，反应速率快，催化作用专一，价格较低等优点。

苯醌类化合物和邻苯二酚衍生物的生产可以借助酚氧化酶，在氧分子存在的条件下，以酚类为氧化底物生产。常用的酚氧化酶包括单酚氧化酶(monophenol oxidase，亦称酪氨酸酶)和多酚氧化酶(polyphenol oxidase，亦称儿茶酚氧化酶)，漆酶(laccase)。其中单酚氧化酶既能催化单酚又能催化邻双酚，多酚氧化酶只能催化邻双酚，漆酶能催化邻双酚和对双酚。

酪氨酸酶(tyr)在自然界分布广泛，是结构复杂的多亚基的含铜氧化还原酶，广泛存在于微生物、动植物及人体中。酪氨酸酶是生物体内黑色素合成的关键酶，与人的衰老，昆虫的伤口愈合与发育，果蔬的褐变等有密切关系，涉及生物、医学、农学、化学、药学等多个学科和领域。酪氨酸酶具有独特的双重催化功能：单酚酶活性(催化单酚生成双酚)和双酚酶活性(催化双酚生成苯醌)。国内外对酪氨酸酶的克隆表达包括细菌、真菌、植物，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，双孢蘑菇(Agaricus bisporus)，米曲霉(Aspergillusoryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)，漏斗大孔菌(Polyporus arcularius)、放线菌中链霉菌(Streptomyces)、苹果(Malus domestica)、葡萄(Vitis vinifera)、蒲公英(Taraxacum officinale)等，但是来源于奥氏蜜环菌(Armillaria ostoyae)的酪氨酸酶未有报道，与漏斗大孔菌酪氨酸酶同源性最高仅为57％。目前商业化酪氨酸酶是从双孢蘑菇中提取的，其提取纯化过程复杂，成本高，产品不纯，通常混有漆酶等同工酶，活性也较低，应用受限，不适于大规模生产应用。因此，寻找一种能够高效、稳定催化酚类化合物是降低双酚化合物和苯醌生产成本的有利途径。异源表达的酪氨酸酶易于纯化分离并可以对其进行改造，以提高酶活及底物特异性，借助分子克隆和异源表达的手段进行高量表达是提高酪氨酸酶产量的一种有效措施。

本发明从奥氏蜜环菌中克隆得到一个酪氨酸酶前体基因，并成功实现了异源表达，该酪氨酸酶前体经胰蛋白酶活化后能高效催化单酚和邻双酚类化合物，其催化单酚和双酚的能力分别是商业化酪氨酸酶的6倍和3倍。在25℃、pH5.0的条件下具有最佳酶活性，并具有高的pH稳定性和较高的温度稳定性。此外此酪氨酸酶前体也可由SDS激发活性，调控反应的起始，并可由不同浓度的SDS调控酶活力。

发明内容