[发明专利]一株产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一株产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌，其特征在于，该重组酵母菌中导入了硫酸软骨素ABC裂解酶基因，所述硫酸软骨素ABC裂解酶基因的核苷酸序列如SEQID NO. 1所示；

包括如下步骤：将SEQID NO. 1所示的硫酸软骨素ABC裂解酶基因导入pPIC9K质粒，得到重组质粒，将重组质粒转化酵母菌，既得到产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌；

所述的酵母菌为毕赤酵母Pichia pastoris GS115。

2.权利要求1所述产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌在制备硫酸软骨素ABC裂解酶、小分子硫酸软骨素中的应用。

3.一种小分子硫酸软骨素的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1) 小分子硫酸软骨素制备：

将大分子硫酸软骨素A粉末配置成水溶液，泵入酶膜反应器的降解反应釜（10）中，向其中加入硫酸软骨素ABC裂解酶，使硫酸软骨素ABC裂解酶的总酶活与硫酸软骨素质量的比例为1 × 10⁴ ~ 6 × 10⁴ U：1 kg，控制转速50 ~ 200 rpm，温度20 ~ 40 °C；当降解反应进行0.5 ~ 1.5 h后，开启酶膜反应器的超滤膜系统（12），小分子硫酸软骨素透过超滤膜进入浓缩釜（13）中，大分子硫酸软骨素被截留返回到降解反应釜（10）中继续降解，硫酸软骨素ABC裂解酶则被截留返回到降解反应釜（10）中循环利用；当浓缩釜（13）中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启纳滤系统（14），水分子透过纳滤膜进入降解反应釜（10）中被循环利用，小分子硫酸软骨素被截留返回到浓缩釜（13）中继续浓缩；

(2) 除菌：对步骤(1)浓缩釜（13）中得到的纳滤截留液进行除菌处理，得到无菌滤液；

(3) 浓缩：将步骤(2)得到无菌滤液通过三效浓缩器浓缩，得到无菌浓缩液；

(4) 干燥：将步骤(3)得到的无菌浓缩液加入喷雾干燥塔内，进风温度185 °C，出风温度90 °C，进行干燥，得到小分子硫酸软骨素成品。

4.根据权利要求3所述小分子硫酸软骨素的生产方法，其特征在于，所述硫酸软骨素ABC裂解酶按照如下方法制备：

将权利要求1所述的产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌YPD液体培养基中，28 °C过夜培养至OD₆₆₀值在3 ~ 8，离心，收集菌泥；用产酶培养基重悬重组酵母细胞，每天补加0.5~ 3%的甲醇，28 °C，220 rpm条件下培养3 ~ 7天；

所述产酶培养基的配方如下：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，3 g/L K₂HPO₄，12 g/LKH₂PO₄，13.4 g/L无氨基酸酵母氮源， 4 × 10^-4 g/L生物素，甲醇5 mL/L。