[发明专利]一株产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一株产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明将来源于普通变形杆菌Proteus vulgaris ATCC33420的硫酸软骨素ABC裂解酶进行异源表达，选取pPIC9K载体，通过甲醇进行诱导，实现了硫酸软骨素ABC裂解酶在毕赤酵母GS115中的分泌表达，并通过设计的硫酸软骨素ABC裂解酶‑酶膜反应器实现了小分子硫酸软骨素的高效连续生产，并使硫酸软骨素ABC裂解酶得到了循环利用，大大降低了生产成本。本发明以食品级酵母菌作为宿主菌株，安全可靠，为工业化绿色生产小分子硫酸软骨素A、B和C提供了有效的参考与借鉴，同时节能减排，经济效益和社会效益显著。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌及其构建方法与应用。

背景技术

硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate)D-葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺的共聚物的硫酸酯盐，共聚物内六碳糖通过β-(1,4)和β-(1,3)糖苷键交替连接，一般约含50～70个双糖单位，分子量在10kDa～50kDa之间。硫酸软骨素作为医疗药物，它们具有降血脂、抗血栓、抗肿瘤、治疗关节炎、动脉硬化、心脑血管疾病、听觉障碍、肾炎、肝炎以及神经痛等作用，还可用作滴眼剂；作为食品添加剂，硫酸软骨素可用于食品的乳化、保湿和祛除异味。

表1硫酸软骨素分类

目前工业生产硫酸软骨素的方法通常包括碱法、酶法、中性盐法以及碱盐法等，虽然工艺不同，但硫酸软骨素分子量一般为10kDa～50kDa，此类硫酸软骨素因分子量较大，人体吸收及生物利用度较低，严重影响了硫酸软骨素的疗效。大量的研究文献证明，分子量在2000Da左右的硫酸软骨素吸收率和生物利用度最好。因此，制备小分子硫酸软骨素具有重要意义。

制备小分子硫酸软骨素的方法有物理降解法、化学降解法、酶解法。物理法主要为加热、机械剪切、超声波破碎和、γ-射线辐照等，可促使硫酸软骨素发生降解。虽然物理降解法处理过程简单，产品易于回收，但是存在一定的缺陷，例如加热法易使产品变色，超声效率较低，γ-射线辐照残留，且产品的稳定性差、分子量范围较大。化学降解方法有水解法和氧化降解法，水解法包括酸水解和碱水解，氧化降解常用的氧化剂为次氯酸钠和过氧化氢。但是，化学降解法引入了化学试剂，反应条件复杂，易给产品的生物活性带来影响和产品的纯化带来困难，且产生大量的工业废水。而酶法降解由于其反应条件温和、便于检测以及生物活性保持较好等特点，成为近年来小分子硫酸软骨素的研究的热点。

硫酸软骨素ABC裂解酶(Chondroitinase,ChSase)是一类能将硫酸软骨素等糖胺聚糖降解为不饱和二糖及寡糖的裂解酶。根据其作用底物的不同分为ChSase ABC,ChSaseAC,ChSase B和ChSase C。硫酸软骨素ABC裂解酶产生菌如表1所示，其中普通变形杆菌Proteus vulgaris是ChSase ABC的主要来源。

表1硫酸软骨素ABC裂解酶产生菌

目前对于ChSase ABC的重组表达研究较少，Prabhakar等虽然构建了Escherichiacoli BL21(DE3)-pET-28a-csl ABC，但是仅仅得到少量的可溶性蛋白，大多的ChSase ABC以包涵体的形式存在。李晔等虽然将P.vulgaris KCTC2579来源的ChSase ABC基因通过融合标签甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH和麦芽糖结合蛋白MBP在E.coli中得到可溶性表达，但是融合标签的存在影响了酶的相关性质。此外，小分子量硫酸软骨素一般用于医药和食品领域，因此大肠杆菌表达的ChSase ABC并不适用于小分子量硫酸软骨素的制备。高慧玲等虽然建立了ChSase ABC分泌型真核表达载体，结果以分泌形式表达，但是人胶质瘤细胞TJ905生产周期较长且培养条件苛刻不适合工业化应用。