[发明专利]一种畜禽沙门氏菌活菌快速检测方法

权利要求书

1.一种畜禽沙门氏菌活菌快速检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)待检样品的制备：取1-5g畜禽制品置于增菌液中37℃过夜培养；

(2)取500μL过夜培养的增菌液于eppendorf管中，2000-3000rpm离心5min,弃上清，沉淀用无菌水悬浮；

(3)样本的PMA处理：取适量PMA工作液加入到上述eppendorf管中，使样品中PMA终浓度为12μg/mL，充分混匀；

(4)将eppendorf管置于冰上，放暗处孵育10min,然后置于卤钨灯下曝光7min；

(5)样本DNA提取：将步骤(4)处理的eppendorf管置于沸水中煮10min，立即放冰上冷却10min，然后10000rpm离心2-3min,上清液即可作为待用的样本DNA模板；

(6)以步骤(5)提取的样本DNA为模板，设计引物，进行荧光定量PCR定量检测样本中的沙门氏菌活菌。

2.根据权利要求1所述的畜禽沙门氏菌活菌快速检测方法，其特征在于，所述PMA为叠氮溴化丙锭。

3.根据权利要求1所述的畜禽沙门氏菌活菌快速检测方法，其特征在于，所述的PMA工作液是将PMA溶解于质量百分比为20％的二甲基亚砜水溶液中，配制成5mg/mL的PMA原液，将PMA原液10倍稀释后即为工作液。

4.根据权利要求1所述的畜禽沙门氏菌活菌快速检测方法，其特征在于，所述的步骤(6)中设计的引物序列分别为：

内引物1：GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA；

内引物2：TCATCGCACCGTCAAAGGAACC；

外引物1：CGTTAAGGCAGTTTACT；

外引物2：CGCTTTAATGAGGGCGGTGCAAGC。

5.根据权利要求1所述的畜禽沙门氏菌活菌快速检测方法，其特征在于，所述的增菌液组成为：在950mL水中加入胰蛋白胨5g、乳糖4g,亚硒酸氢钠4g,磷酸二氢钠10g,NaCl 5g，甘露醇2g,混匀，定容至1L，灭菌。

6.根据权利要求1所述的畜禽沙门氏菌活菌快速检测方法，其特征在于，所述的步骤(6)PCR过程的PCR反应体系为：

反应条件为：95℃预变性1min；95℃变性30s,60℃退火30s 45个循环。

7.根据权利要求6所述的畜禽沙门氏菌活菌快速检测方法，其特征在于，所述的引物混合物由体积比为1：1：4：4的100μM外引物1、外引物2、内引物1和内引物2组成。