[发明专利]一种畜禽沙门氏菌活菌快速检测方法

说明书

本发明公开了一种畜禽沙门氏菌活菌快速检测方法，该方法利用PMA能与待检样品中死菌胞内DNA结合，而不与活菌细胞DNA结合的特性，通过荧光定量PCR检测样品中沙门氏菌活菌的活菌数。本发明方法可以只检测出沙门氏菌活菌并进行计数。将此方法运用到畜禽制品中的沙门氏菌的检测，并与传统的细菌培养计数方法进行比较，结果证明本发明灵敏快速、污染率低、成本低，能准确地对沙门氏菌活菌进行定性和定量检测，可用于对畜禽制品沙门氏菌污染的监测。

技术领域

本发明涉及致病菌的快速检测领域，具体涉及一种畜禽沙门氏菌活菌快速检测方法。

背景技术

食源性致病菌是引起食源性疾病的主要因素之一，在世界食品安全领域中备受关注。WHO报告表明，全球每年发生40～60亿例食源性疾病，其中约70％是因生物源性污染食品所致。发展中国家每年约有180万人口死于食源性疾病，即使是在发达国家，每年亦有10％以上的人群感染食源性疾病^[3,4]。目前世界公认的能引起食源性疾病的重要致病菌，如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157、志贺氏菌等广泛存在于奶制品、蔬菜、水产品、肉制品等多种食物中，是引起食品污染的重要因素^[5]。因此，食源性致病菌的有效检测对于监控食品安全是非常重要的，如何区分活菌与死菌，致病菌与非致病菌所造成的污染是有效检测食源性致病菌的关键环节。食源性疾病不但严重危害人们的健康，而且造成巨大的经济损失。

因为只有“活”的病菌才能保留原菌的毒力和致病性，才对食品安全构成潜在的威胁。而经过高温、紫外线等各种途径灭活的“死”病菌已经丧失原菌毒力和致病性，并不会威胁到食品安全。因此食源性病原菌的检测关键是要区分“活”菌与“死”的菌、致病菌与非致病菌，并准确计算“活”菌的含量。目前，用于活菌检测的技术主要包括分离培养鉴定、ATP生物发光法、分子生物学检测技术、免疫学技术、流式细胞仪技术、EMA-qPCR活菌检测技术等，但都存在着各方面的不足。因此开发一种简单快速的沙门氏菌活菌检测方法就显得非常重要。因此，通过本发明，建立一种畜禽沙门氏菌活菌快速检测方法，为食品安全的快速检测提供更多的选择。

发明内容

本发明的目的在于提供一种畜禽沙门氏菌活菌快速检测方法，为食品安全的快速检测提供更多的选择。本发明通过以下技术方案完成：

(1)待检样品的制备：取1-5g畜禽制品置于增菌液中37℃过夜培养。

(2)取500μL过夜培养的增菌液于eppendorf管中，2000rpm-3000离心5min,弃上清，沉淀用无菌水悬浮。

(3)样本的PMA处理：取适量PMA工作液加入到上述eppendorf管中，使样品中PMA终浓度为12μg/mL，充分混匀。

(4)将eppendorf管置于冰上，放暗处孵育10min,然后置于卤钨灯下曝光7min。

(5)样本DNA提取：将步骤(4)处理的eppendorf管置于沸水中煮10min，立即放冰上冷却10min，然后10000rpm离心2-3min,上清液即可作为待用的样本DNA模板。

(6)以步骤(5)提取的样本DNA为模板，设计引物，进行荧光定量PCR定量检测样本中的沙门氏菌活菌。

所述PMA为叠氮溴化丙锭(propidium monoazide)；所述的PMA工作液是将PMA溶解于20％的二甲基亚砜(DMSO)中，配制成5mg/mL的PMA原液，将PMA原液10倍稀释后即为工作液。所述的引物序列分别为：

内引物1：GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA，(如SEQ ID NO.1所示)；

内引物2：TCATCGCACCGTCAAAGGAACC；(如SEQ ID NO.2所示)；