[发明专利]一种普鲁兰酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种普鲁兰酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明构建了一种普鲁兰酶突变体，得到的单突变体K419R(第419位赖氨酸突变为精氨酸)的酶活是野生型的1.3，67℃保温30min剩余酶活达67.3U/mg；迭代突变体K419R+Y102C+K383C(第419位赖氨酸突变为精氨酸，第102位酪氨酸和第383位赖氨酸分别突变为半胱氨酸)的酶活提高为野生型的2倍，在67℃保温30min剩余酶活达88.3U/mg，为保温前的43.1％，具有较好的热稳定性。本发明的普鲁兰酶突变体能够应用于淀粉糖化过程。

技术领域

本发明涉及一种普鲁兰酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

普鲁兰酶是α-1,6-糖苷键水解酶，能够专一、高效地切割支链淀粉中的支链，被广泛地应用于现代淀粉糖工业中，成为高品质糖浆生产过程中的关键酶制剂。淀粉糖化过程需要在高温(60-65℃)下进行，糖化时间一般为48-60h，因此，普鲁兰酶必须具备在高温下保持较高酶活性和稳定性的能力。

淀粉糖化生产的葡萄糖浆不但可以生产结晶葡萄糖、高果糖浆，还可以作为最主要的发酵碳源，因此现阶段对能够与糖化酶复配的普鲁兰酶的开发也尤为重要。近年来，国内对普鲁兰酶的研究逐渐升温，取得了许多较好的研究成果，但是在高活性、耐热普鲁兰酶的开发上仍然存在一些问题，主要表现为开发的普鲁兰酶难以同时满足淀粉糖化过程对普鲁兰酶性质的苛刻要求。

本发明使用的野生型普鲁兰酶在最适反应条件下比酶活为102.7±1.7U/mg，67℃保温30min残余酶活仍剩余50％以上。其热稳定性较诺维信公司的商业普鲁兰酶(60℃，pH5.0条件下半衰期仅为35min)有明显优势。因此，如果能够通过基因工程和分子生物学手段对本发明使用的野生型普鲁兰酶进行酶学性质改造，提高其比活力，那么就可能打破国外公司对该酶的长期垄断地位，使我国在普鲁兰酶工业应用领域有自主产权和技术。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种普鲁兰酶突变体，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的普鲁兰酶第419位氨基酸进行突变；

或，同时将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的普鲁兰酶第419位、第102位、第383位氨基酸进行突变。

在本发明的一种实施方式中，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ IDNO.1的普鲁兰酶第419位赖氨酸突变为精氨酸得到的，突变体命名为K419R。

在本发明的一种实施方式中，所述酶突变体是通过同时将出发氨基酸序列为SEQID NO.1的普鲁兰酶第419位赖氨酸突变为精氨酸、第102位酪氨酸突变为半胱氨酸、第383位氨基酸赖氨酸突变为半胱氨酸得到的，突变体命名为K419R+Y102C+K383C。

所述普鲁兰酶的来源为Anoxybacillus sp.WB42。

所述普鲁兰酶突变体的基因。

携带普鲁兰酶突变体基因的载体。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种普鲁兰酶突变体的方法，包括如下步骤：

(1)在普鲁兰酶氨基酸序列上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带普鲁兰酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体的质粒载体；

(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；

(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，分别纯化普鲁兰酶突变体K419R和迭代突变体K419R+Y102C+K383C。

携带普鲁兰酶突变体的基因或普鲁兰酶突变体基因的载体的宿主细胞。

所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

所述普鲁兰酶突变体在淀粉糖化中的应用。