[发明专利]一种基因点突变修复的新方法在审
| 申请号： | 201811428895.3 | 申请日： | 2018-11-27 |
| 公开（公告）号： | CN109536527A | 公开（公告）日： | 2019-03-29 |
| 发明（设计）人： | 高飞;陈敏;郭文秀;崔秀宏 | 申请（专利权）人： | 中国科学院动物研究所 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/90;C12N15/10 |
| 代理公司： | 天津滨海科纬知识产权代理有限公司 12211 | 代理人： | 孙晓凤 |
| 地址： | 100101 北*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 突变位点 修复 表达载体 点突变 细胞 电转 携带 基因 成纤维细胞系 目标基因组 原发性闭经 充分混合 基因突变 基因位点 基因修复 体外培养 细胞基因 转染效率 构建 体外 位点 小鼠 蛋白 女性 上游 疾病 治疗 申请 | ||
1.一种基因点突变修复的新方法，其特征在于，主要步骤如下：
(1)在目标基因组序列中，选定细胞基因突变位点为修复的基因位点；
(2)根据选定的基因修复位点，设计CRISPR/Cas系统的sgRNA；
(3)将sgRNA构建到携带CRISPR/Cas9蛋白的表达载体上；
(4)在突变位点的上游或下游附近选取一段正确的序列，并由此设计Donor DNA，作为基因突变修复的模板；
(5)体外培养携带突变位点基因的细胞；
(6)利用电转染的方法，将sgRNA和CRISPR/Cas9的表达载体、Donor DNA转染到细胞中。
2.根据权利要求1所述的一种基因点突变修复的新方法，其特征在于，选定基因的突变位点为Msh5点。
3.根据权利要求2所述的一种基因点突变修复的新方法，其特征在于，该Msh5点存在于女性生殖细胞中。
4.根据权利要求1所述的一种基因点突变修复的新方法，其特征在于，Msh5突变位点所对应的sgRNA序列为：
Guide#1：CTATCGTAGCGCCCGGACCAAGG
Guide#8：CAAGGAGCTGTACACGCTGCTGG。
5.根据权利要求4所述的一种基因点突变修复的新方法，其特征在于，
Guide#1的上游引物及下游引物序列分别为：
F-CACCGCTATCGTAGCGCCCGGACCA
R-AAACTGGTCCGGGCGCTACGATAGC；
Guide#8的上游引物及下游引物序列分别为：
F-CACCGCAAGGAGCTGTACACGCTGC
R-AAACGCAGCGTGTACAGCTCCTTGC。
6.根据权利要求1所述的一种基因点突变修复的新方法，其特征在于，CRISPR/Cas9蛋白的表达载体为pCS(eGFP)载体。
7.根据权利要求1所述的一种基因点突变修复的新方法，其特征在于，
Donor DNA的序列为：
CAGTTTCTCTCAGAGGACAAGCTGCACTATCGTAGCGCCCGGACCAAGGAGCTGGACACGCTGCTGGGAGACCTGCACTGCGAGATCCGGGGTGAGGAGCCCGTGGTAGGAGGGGGCAGGCTGCTCTAAC。
8.根据权利要求1所述的一种基因点突变修复的新方法，其特征在于，电转染的脉冲电源电压为33V，脉冲间隔50ms～950ms，正反向各4次。
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