[发明专利]一种基因点突变修复的新方法

说明书

本发明提供了一种基因点突变修复的新方法，主要步骤如下：在目标基因组序列中，选定细胞基因突变位点为修复的基因位点；根据选定的基因修复位点，设计CRISPR/Cas系统的sgRNA；将sgRNA构建到携带CRISPR/Cas9蛋白的表达载体上；在突变位点的上游或下游附近选取一段正确的序列，并由此设计Donor DNA，作为基因突变修复的模板；体外培养携带突变位点基因的细胞；利用电转染的方法，将sgRNA和CRISPR/Cas9的表达载体、Donor DNA转染到细胞中。本申请的方法是将Cas9表达载体、sgRNA，以及Donor DNA与体外建立的携带Msh5点突变的小鼠成纤维细胞系充分混合，然后对细胞系进行电转染处理，增加细胞的转染效率，并利用CRISPR/Cas9系统对这种突变位点进行修复，从而为治疗女性原发性闭经疾病提供科学依据。

技术领域

本发明属于基因修复技术领域，尤其是涉及一种基因点突变修复的新方法。

背景技术

CRISPR/CAS9系统是近年来发展起来的一种新的高效基因编辑技术，它可以在细胞水平对基因组进行删除、修改。CRISPR/CAS系统自2013年初公布之后，很快便在全世界范围内得到了广泛地应用，并且被《SCIENCE》杂志评为2015年十大科学突破之一。CRISPR/CAS9是一种RNA-蛋白质的复合体，常用的是CAS9核酸酶，由1409个氨基酸组成，有2个重要的核酸酶结构域，分别是RUVC和HNH结构域。HNH结构域负责断裂通过靶向互补的DNA单链，切割位点位于PAM(PROTOSPACER-ADJACENT MOTIFS)序列上游3NT处。RUVC结构域负责断裂另一条DNA链，切割位点位于PAM序列上游3～8NT处。RNA-DNA双链在PAM位点开始形成。CR-RNA/TRANCR-RNA结合在PAM序列的附近，通过RUVC和HNH结构域诱导CAS9核酸酶的活性。目前通过基因工程的方法已经将CR-RNA和TRACR-RNA这两种RNA，简化成具有相同功能的sgRNA。

利用CRISPR/CAS9系统对突变基因进行编辑在医学研究方面的应用颇为广泛，在HIV的治疗，遗传疾病治疗，如亨丁顿舞蹈病的治疗，癌症治疗，血液疾病方面以及眼部疾病等方面的治疗都取得了显著的进展，为疾病的研究打开了新的大门。

我们的前期研究发现了一种能导致女性原发性闭经的遗传突变(TING GUO ETAL,2017,HUMAN MOLECΜLAR GENETICS)，该突变位于Msh5基因1459位点的G到C的突变，该突变导致Msh5不能正常行驶功能，从而使得生殖细胞减数分裂过程不能完成，最终引起生殖细胞死亡。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种基因点突变修复的新方法，利用电转染技术和高效的基因编辑技术CRISPR/Cas9系统相结合的治疗方法体外修复生殖细胞。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种基因点突变修复的新方法，主要步骤如下：

(1)在目标基因组序列中，选定细胞基因突变位点为修复的基因位点；

(2)根据选定的基因修复位点，设计CRISPR/Cas系统的sgRNA；

(3)将sgRNA构建到携带CRISPR/Cas9蛋白的表达载体上；

(4)在突变位点的上游或下游附近选取一段正确的序列，并由此设计Donor DNA，作为基因突变修复的模板；

(5)体外培养携带突变位点基因的细胞；

(6)利用电转染的方法，将sgRNA和CRISPR/Cas9的表达载体、Donor DNA转染到细胞中。

进一步，选定基因的突变位点为Msh5点。

进一步，该Msh5点存在于女性生殖细胞中。