[发明专利]一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞DNA损伤的方法

权利要求书

1.一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞DNA损伤的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)样品前处理：采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0mL，持续时间3s，抽吸频率为30s的抽吸条件下，连续抽吸10口，用直径为44mm的剑桥滤片捕集，分别于抽吸前、抽吸后称量烟气捕集器的质量，按照公式(1)计算加热不燃烧卷烟总粒相物的质量mTPM；

mTPM＝m₁-m₀ (1)

式中：

m₀——抽吸前烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；

m₁——抽吸后烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；

捕集完毕后，将捕集后的剑桥滤片放入50mL的三角瓶中，加入二甲基亚砜，使加热不燃烧卷烟总粒相物在二甲基亚砜中的浓度为40mg/mL；将此三角瓶置于超声仪上超声30min；再用无菌滤纸过滤收集二甲基亚砜萃取液，分装至1mL的冻存管中，-80℃保存待用；

(2)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的制备：人鼻腔上皮细胞RPMI2650复苏后，接种到25cm²细胞培养瓶中，加入10mLRPMI1640细胞培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的RPMI1640细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用RPMI1640细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；

(3)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤(2)所得人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

(4)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的接种：将步骤(3)计数后的人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液用RPMI1640细胞培养基稀释至2.0×10⁵个/mL，再按接种量为2mL/孔接种到6孔细胞培养板中，然后将6孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱内培养24h；

(5)受试物暴露：把步骤(1)中制备的样品用PBS稀释成400μg/mL的工作液备用，取出6孔细胞培养板，去除细胞培养液，将不同剂量的待测液加入细胞培养板中，每个剂量设3个复孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h；

(6)收集细胞：取出步骤(5)中的细胞培养板，将同一培养孔中的细胞培养液和消化后的细胞收集到同一个15mL离心管中，不同培养孔分开收集，1000r/min转速下离心5分钟，弃上清液；

(7)细胞固定：在步骤(6)每支离心管中加入1mL4℃预冷的70％的乙醇，轻轻吹打均匀，4℃固定2h；1000r/min转速下离心5分钟，弃上清液，加入500μL4℃预冷的PBS缓冲液，重悬细胞，1000r/min转速下再次离心5分钟，弃上清液，获得细胞；

(8)封闭：取步骤(7)获得的细胞加入分别含0.2％TritonX-100和10％FBS的PBS200μL，1000r/min转速下离心5分钟，弃上清，获得细胞；

(9)细胞破膜：取步骤(8)获得的细胞，分别加入体积百分比0.2％的TritonX-100和质量体积比0.1％的BSA的PBS溶液1mL重悬细胞，处理固定细胞20min以使细胞膜通透；1000r/min转速下离心5分钟，弃上清；加入5ml PBS重悬细胞，1000r/min转速下再次离心5分钟，获得细胞；

(10)细胞染色：加入FITC标记的γH2AX抗体工作液100μL，避光孵育3h；1000r/min转速下离心5分钟，弃上清液；加入300μLPBS重悬细胞；

(11)流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测，进行荧光强度分析。