[发明专利]一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞DNA损伤的方法

说明书

本发明公开一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞DNA损伤的方法，包括以下步骤：(1)样品前处理；(2)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的制备；(3)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度计算；(4)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的接种；(5)受试物暴露；(6)收集细胞；(7)细胞固定；(8)染色；(9)流式检测和分析。本发明样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞周期的影响。

技术领域

本发明属于烟草制品的安全性生物学效应评价技术领域，特别涉及一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞DNA损伤的方法。

背景技术

随着人们对健康的关注越来越高，对烟草产品提出了更高的要求，不但要有较好的口感，而且要尽可能的减少人体的不良感受。加热不燃烧卷烟制品避免了传统卷烟制品燃烧所产生的复杂混合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。

加热非燃烧型卷烟，其特征在于加热烟草而非燃烧烟草，向消费者提供一定的烟草特征感受。加热不燃烧卷烟制品研发人员在产品配方设计初期，将不同组份按照不同比例组合调配，形成具有不同风格的初选配方，再结合化学评价和感官评价对配方进行不断筛选调整，形成最终的产品配方。但初选配方数量众多，全部进行感官评价耗时耗力，且感官评价侧重于对产品的风格口感进行筛选，如何利用生物学测试技术对产品初选配方进筛选，以获得降低人体不良感受的产品配方，目前尚属探索阶段，并无统一的标准方法。

DNA损伤有多种形式，如DNA单链断裂、DNA与DNA的交联、DNA与蛋白质的交联、DSBs等。其中，DSBs会影响DNA双螺旋结构，被认为是DNA损伤最严重的形式，这种损伤若不被及时修复或被错误修复，会导致DNA遗传物质发生转变从而引发肿瘤及遗传性损伤。DSBs发生后，位于DSBs附近的磷脂酸激酶3肌醇家族成员迅速聚集于DNA断裂发生位点磷酸化形成γH2AX，它被认为是一种早期检测DSBs的最有效的生物学标志物，能够更为灵敏的检测到受试物对细胞潜在的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞DNA损伤的方法，其以加热不燃烧卷烟总粒相物作为检测基础，为准确评价加热不燃烧卷烟制品对安全性评估提供有效测定方法。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为体积百分数。

本发明中所使用的RPMI1640细胞培养基购买于市场任何可购买到的商品公司。

一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞DNA损伤的方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理：采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0mL，持续时间3s，抽吸频率为30s的抽吸条件下，连续抽吸10口，用直径为44mm的剑桥滤片捕集，分别于抽吸前、抽吸后称量烟气捕集器的质量，按照公式(1)计算加热不燃烧卷烟总粒相物的质量mTPM；

mTPM＝m₁-m₀ (1)

式中：

m₀——抽吸前烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；

m₁——抽吸后烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；

捕集完毕后，将捕集后的剑桥滤片放入50mL的三角瓶中，加入二甲基亚砜，使加热不燃烧卷烟总粒相物在二甲基亚砜中的浓度为40mg/mL；将此三角瓶置于超声仪上超声30min；再用无菌滤纸过滤收集二甲基亚砜萃取液，分装至1mL的冻存管中，-80℃保存待用；