[发明专利]唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法

权利要求书

1.唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：分别称取5mg糖蛋白样品1和2各三份，利用PNGase F酶分别进行N-糖链的释放；释放的N-糖链样品依次经过C18固相萃取柱和石墨碳固相萃取柱纯化，得到纯化的N-糖链样品1和2各三份；

S2：S1中纯化的N-糖链样品1和2各取两份；

（a）第一份利用d0-苯胺通过酰胺化方法对糖链的唾液酸进行标记，然后利用固相萃取技术除去中性糖链，唾液酸化糖链还原末端标记吉拉德试剂P(GP) 以屏蔽活性醛基和提高后续质谱检测灵敏度，得到d0-苯胺和GP标记的唾液酸化N-糖链衍生物，记为d0-苯胺衍生物；

（b）第二份利用d5-苯胺进行唾液酸连接异构体的特异性衍生，其中先使α2,3-连接唾液酸形成内酯，然后使α2,6-连接唾液酸发生酰胺化；再进行GP标记，得到特异性糖链衍生物，记为d5-苯胺衍生物；

S3：将S2中获得的N-糖链样品1的d0-苯胺衍生物和d5-苯胺衍生物进行混合，N-糖链样品2的d0-苯胺衍生物和d5-苯胺衍生物进行混合，利用反相高效液相色谱和质谱联用技术（RP-HPLC-MS）对N-糖链样品1和2的唾液酸化糖链连接异构体分别进行鉴定；

S4：S1中纯化的N-糖链样品1和2各取余下的那一份，参考S2中（a）步骤，对N-糖链样品1和2通过酰胺化反应分别标记d0-苯胺和d5-苯胺，混合两种样品，然后标记GP，用反相高效液相色谱和质谱联用技术（RP-HPLC-MS）进行检测，对每个糖链提取离子流图（EIC），并根据同位素目标峰的峰面积比值进行样品间的定量比较分析。

2.根据权利要求1所述的唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法，其特征在于：步骤S1，具体是：将每份糖蛋白样品溶于500μL蛋白变性液，100℃加热10min，当样品冷却后，加入50μL pH 7.5的磷酸盐缓冲液、50μL 10%（v/v）的NP-40溶液和2μL PNGase F酶，37℃反应24h；释放的N-糖链依次经过C18固相萃取柱和石墨碳固相萃取柱纯化，得到纯化的N-糖链样品。

3.根据权利要求2所述的唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法，其特征在于：步骤S1中，所述蛋白变性液为0.4M的二硫苏糖醇（DTT）和5%十二烷基磺酸钠(SDS)；磷酸盐缓冲液为1M磷酸钠，用磷酸调pH值为7.5；2μL PNGase F酶为1000酶单位。

4.根据权利要求2所述的唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法，其特征在于：步骤S1中，C18固相萃取柱纯化过程为：C18固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后上样，10倍柱体积双蒸水洗脱糖链；

石墨碳固相萃取柱纯化过程为：石墨碳固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后将经C18固相萃取柱纯化的样品上样，上样后先用10倍柱体积双蒸水洗脱除盐，然后用5mL 含有0.1%三氟乙酸的25%乙腈水溶液洗脱样品，收集洗脱液，冻干，得纯化后的N-糖链样品。

5.根据权利要求1所述的唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法，其特征在于：步骤S2和S4中，得到酰胺化标记的唾液酸化N-糖链衍生物的过程具体是：

向S1所得的N-糖链样品中加入450μL 1M d0/d5-苯胺和90μL 2M 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC），并且用盐酸调节pH值至4.5，反应6h；

依次通过微晶纤维素柱和C18固相萃取柱纯化样品和除去中性N-糖链，得到酰胺化标记的唾液酸化N-糖链衍生物；或者，依次通过纸色谱柱和C18固相萃取柱纯化样品并且除去中性糖链，得到酰胺化标记的唾液酸化N-糖链衍生物。