[发明专利]唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法

说明书

本发明提出了一种唾液酸化糖链同分异构体的高分辨顺序分离和准确定量分析方法，包括：利用PNGase F酶对糖蛋白上的N‑糖链进行释放；糖链的唾液酸通过酰胺化方法标记同位素试剂(d0/d5‑)苯胺，以对唾液酸进行保护和稳定同位素标记；利用固相萃取技术(C18柱)除去中性糖链，以避免中性糖链的干扰；唾液酸化糖链的还原末端再标记上吉拉德试剂P(GP)以屏蔽活性醛基和提高质谱检测灵敏度；唾液酸的特异性衍生技术对连接异构体进行识别；最后使用RP‑HPLC‑MS技术对上述处理过的唾液酸化糖链衍生物的同分异构体进行区分、鉴定和定量分析。该方法通用性强，首次实现了在同分异构体水平对唾液酸化糖链的准确定量分析。

技术领域

本发明属于糖生物学技术领域，具体涉及一种在异构体水平对唾液酸化糖链进行相对定量的方法。

背景技术

糖链以游离寡糖、糖脂和糖蛋白等形式在细胞识别、细胞粘附、细菌感染、信号转导、免疫反应等多种生命过程中发挥着重要的作用，具有作为多种疾病生物标志物的潜力，因此糖链的相关研究正在受到越来越多的关注。唾液酸，一组9碳糖结构单元，位于许多游离寡糖链、N-糖链、O-糖链和糖脂糖链的非还原末端，对于糖链结构的稳定性和生物功能的发挥具有重要意义。在哺乳动物体内普遍存在两种唾液酸形式，N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)和N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)，但是人体中在正常部位只含有N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)，只在癌症部位才存在N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)。在N-糖链中唾液酸通过α2-3或α2-6连接方式与糖链非还原末端的半乳糖残基相连，通过α2-6连接方式与N-乙酰葡萄糖残基相连，并且经研究发现，α2-3和α2-6连接方式的改变与流感病毒感染和乳腺癌、胃癌、膀胱癌等有着密切的联系。因此对唾液酸化糖链同分异构体的准确定量分析对多种疾病的诊断具有重要意义。

近年来，质谱已经作为糖链定性定量分析的一种重要检测工具而被广泛应用，但是由于低离子化效率、唾液酸的不稳定性、高分子量和多种异构体形式，唾液酸化糖链在质谱的分析检测中存在诸多困难。因此为了提高唾液酸化糖链的离子化效率和稳定唾液酸，几种针对唾液酸的衍生化方法被发明，如全甲基化、酯化和酰胺化。全甲基化方法是对唾液酸化糖链的羟基、醛基、胺基和羧基组分进行甲基化修饰，从而极大提高糖链的质谱检测灵敏度和稳定性，但是由于苛刻的反应条件和糖链存在大量的修饰位点，例如，双天线唾液酸N-糖链(GlcNAc₄Man₃Gal₂Neu5Ac)存在39个修饰位点，因此在同位素标记过程中即使存在很小的标记效率差异也会导致定量结果存在很大的误差。酯化方法也是唾液酸的一种常用衍生化方法，但是由于在酸碱条件下，酯键的不稳定性，对唾液酸化糖链的检测分析并不适用。酰胺化反应由于反应条件温和，反应效率高，酰胺键的稳定性，已经成为唾液酸化糖链研究的一种常用衍生化方法,并且可以实现对唾液酸化糖链的定量分析，但是这种方法至今没有实现对唾液酸连接异构体的有效区分。

目前对唾液酸连接异构体的区分主要有酶法和化学法两种。酶法是利用糖苷外切酶Sialidase S能特异性识别α2-3连接的唾液酸并且对其进行水解，再结合HILIC-MS技术对唾液酸化糖链连接异构体进行区分及定量。这个方法对唾液酸连接异构体进行了精确区分及定量，但是由于酶效较低及其昂贵价格，不适用于对唾液酸糖链的高通量分析，并且没有实现多组样品间的定量比较分析。相比之下化学法成本较低，适合范围广，适于对唾液酸化糖链异构体的高通量定性分析。目前的化学识别方法为唾液酸特异性衍生化方法，主要是在存在缩合试剂的二甲基亚砜溶液中，在加热条件下，α2-3连接的唾液酸发生内酯化，α2-6连接的唾液酸与标记试剂发生酯化或者酰胺化，再利用分子量的差异分辨唾液酸化糖链的连接异构体。这个方法极大的简化了α2-6和α2-3连接唾液酸的识别，但是对含有多个唾液酸糖链的样品通过同位素标记进行定量分析时，对质谱分辨率的要求会很高，并且质谱图将会高度复杂，对后面的定量分析会造成极大困难。

综上所述，现有的唾液酸化糖链的研究技术存在的主要问题是无法实现在唾液酸糖链同分异构体水平的准确定量分析。

发明内容