[发明专利]一种体外诱导iPS细胞向乳腺方向分化的方法及其专用培养基

说明书

本发明公开了一种体外诱导iPS细胞向乳腺方向分化的方法及其专用培养基。该体外诱导方法包括以下步骤：将iPS细胞消化为单细胞，以该单细胞作为种子细胞接入iPS细胞维持培养基，并获得高密度单层细胞；将单层iPS细胞在分化培养基I中进行培养，细胞每天换液；弃去培养基，更换为分化培养基II培养，细胞进行隔天换液；弃去培养基，更换为分化培养基III培养细胞，细胞进行隔天换液；弃去培养基，更换为分化培养基IV继续培养细胞。本发明可获取大量、单一、处在不同分化阶段的乳腺细胞，具有操作简单、成本低廉和分化效率高等优点，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于发育生物学和生物医学工程技术领域。具体地，涉及一种体外诱导iPS细胞向乳腺方向分化的方法及其专用培养基；更具体地，涉及一种基于体外定向诱导分化，把iPS细胞向乳腺细胞转变，获得大量、单一、处在不同分化阶段的乳腺细胞的方法及其专用培养基。

背景技术

干细胞因具有自我更新及多向分化潜能在生命科学、生物、医疗等各个领域备受关注。目前，全球范围内针对干细胞的研究层出不穷，从血液病到组织损伤修复到抗衰老，干细胞技术正逐步从临床基础研究过渡到临床应用阶段，为许多传统医学难以解决的重大临床问题带来了新希望。干细胞治疗已成为血液系统疾病、神经系统疾病、心血管及肝脏疾病等重大疾病的新的治疗选择。

乳腺癌是女性发病率最高的肿瘤类型。家族遗传性乳腺癌，如BRCA1突变导致的三阴性乳腺肿瘤，临床上转移、复发率高，是最难治疗的乳腺肿瘤类型之一。而BRCA1突变携带者一生罹患乳腺肿瘤的风险高达40%～80%，患病后，病人5年生存率仅为10%，因此，阐明相关突变诱发肿瘤发生、发展的过程，发现潜在治疗靶点，阻断肿瘤起始，对家族性乳腺肿瘤的防治意义重大。癌变发生过程的阐明依赖于疾病模型。然而，目前尚无研究体系可在人乳腺发育水平模拟遗传性肿瘤发生的过程，如源自病人肿瘤组织的细胞系无法重现癌变发生的进程、小鼠模型具种属缺陷等。

诱导多能干细胞应用于乳腺疾病研究中具有巨大的潜在优势。iPS细胞可从患者自身体细胞直接诱导而获得，保留了疾病基因组的遗传信息，具有分化为任意细胞的潜能，因而，可在体外模拟疾病的病理进程与表型。早在2013年，Soyombo研究组已将BRCA1突变家系病人的体细胞重编程为iPS细胞。2017年，Qu等实现了人iPS细胞以3D形式分化为类乳腺结构，然而，该体外诱导分化方法在组织工程，及疾病模型建立的应用中均存在一定的缺陷。该分化方法存在以下不足：1、体外诱导分化过程中未对细胞命运进行足够人为干预，导致分化效率低。尤其是在分化早期，细胞以EB球的形式随机分化，而诱导分化的培养基仅起到将随机分化而来的乳腺方向的细胞进行富集。在胚胎发育中，乳腺细胞来自表皮外胚层，由于诱导多能干细胞具有朝三个胚层分化的潜能，上述方法随机分化阶段，仅部分细胞向外胚层分化，且主要为神经外胚层，而非表皮外胚层细胞，因而，基于随机分化的乳腺细胞得率低。2、体外诱导分化过程中细胞始终以EB球，或包被了基质胶的悬浮球的形式培养，最终获得的类乳腺结构同样被包被在基质中，难于分离到足够的、处在特定分化阶段的乳腺上皮细胞。3、鉴于上述两个技术特点，该分化方法步骤繁琐，乳腺细胞得率低，难以获得大量、单一、处在不同分化阶段的乳腺细胞。

综上所述，由于缺乏iPS细胞诱导乳腺分化的有效方法，极大限制了干细胞在乳腺疾病领域的应用，开发新型iPS细胞乳腺诱导分化方法意义重大。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种新的体外诱导iPS细胞向乳腺方向分化的方法。本发明所述诱导iPS细胞向乳腺方向分化的方法，可获得大量、单一、处在不同分化阶段的乳腺细胞，易于体外扩增，足量、质优，为乳腺干细胞在组织工程中的应用及疾病模型建立创造了条件。

本发明的另一目的是提供一种用于体外诱导iPS细胞定向分化为乳腺细胞的培养基。

本发明的再一目的是提供使用上述方法或上述培养基诱导得到的乳腺细胞。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：