[发明专利]一种基于小麦黄条纹病毒G蛋白的多克隆抗体、制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种基于小麦黄条纹病毒G蛋白的多克隆抗体、制备方法及其应用。多克隆抗体的制备包括以下步骤：根据WYSV的G基因的序列，首次优化密码子合成了该基因并亚克隆到用于大肠杆菌表达的靶载体pET‑30a中；重组蛋白经原核表达，免疫新西兰大白兔制备得到了WYSV G蛋白的多克隆抗体。Western blot检测表明制备的抗体能与G重组蛋白、感病小麦样品有特异性结合，说明获得的抗体特异性高。基于制备的多克隆抗体建立了检测WYSV的DIBA杂交方法，能够特异、灵敏并且快速地检测田间禾本科农作物是否感染WYSV病毒。

技术领域

本发明属于农业生物学技术领域，具体地涉及一种WYSV多克隆抗体、制备方法和基于抗体建立的免疫检测试剂盒以及应用，从而达到快速、高效检测WYSV的目的。

背景技术

小麦是我国的主要粮食作物之一，其安全生产关乎民生。近年来，小麦上的病毒病发生较重，尤其是大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus，BYDV)引起的小麦黄矮病和小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus，WYMV)引起的小麦黄花叶病，造成小麦严重减产和巨大经济损失。此外，小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus,WDV)引起的小麦矮缩病毒病，是由介体异沙叶蝉(Psammotettix striatus L.)以持久非增殖方式传播，小麦矮缩病毒罹病植株典型症状表现为矮化、黄化和分蘖增多等，在我国西北部局部麦区造成严重危害。小麦黄条纹病毒(Wheat yellow striate virus,WYSV)是2016年陕西韩城病害田间调查时发现的一种新的细胞核弹状病毒，也是由异沙叶蝉传播到小麦、大麦等禾本科作物上。与小麦矮缩病毒病产生的症状不同，受WYSV侵染的小麦无明显矮化，表现为严重黄化、发病叶片沿叶脉失绿，逐渐发展为从叶尖开始干枯，最后枯死。WYSV为负义单链RNA病毒，整个WYSV基因组全长为14,486nt，含有7个开放阅读框(ORF)，在反义链上以“N-P-P3-M-G-P6-L”顺序依次编码蛋白。为进一步了解这种病毒病的发生、流行规律、建立早期监测和预警体系，急需建立快速、高效的病毒检测方法。

植物病毒的检测方法通常有生物学、血清学和分子生物学等手段。但就WDV和与新病毒WYSV而言，由于两种病毒均由异沙叶蝉传播，症状上又有相似之处，生物学鉴定无法完成鉴别；以PCR为代表的分子生物学手段具有快速、高度灵敏等特点，但需要昂贵的仪器和分子生物学试剂，且不适合大批量样品的检测；血清学具有快速简便、高通量等优点，且适合田间大规模样品检测，因此被广泛应用于植物病毒的诊断、流行规律的分析、预测预警、科学防控和抗病育种等方面。

发明内容

本发明的目的是提供一种小麦黄条纹病毒WYSV-G的抗体，并以此抗体为基础建立了斑点免疫杂交快速检测方法(Dot Immunobinding Assay,DIBA)，同时提供了一种快速、便捷、灵敏以及特异性好的相应试剂盒。

一种基于小麦黄条纹病毒G蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：以小麦黄条纹病毒G蛋白为免疫原通过大肠杆菌原核系统表达重组蛋白，纯化后得到的G蛋白抗原通过皮下多点注射新西兰大白兔制备得到多克隆抗体。

所述重组蛋白表达是将含有经密码子优化的小麦黄条纹病毒G蛋白重组质粒转入到大肠杆菌DL21原核系统中进行表达。

所述重组质粒是将含小麦黄条纹病毒G蛋白中第115至1828nt的核苷酸经密码子优化并添加有酶切位点、His标签以及终止密码子，按NdeI--(WYSV-G)--His tag--Stopcodon—HindIII的顺序合成基因，利用无缝克隆技术将合成基因转入载体pET-30a中，合成基因的氨基酸的序列如SEQ ID No.1，所述合成基因的核苷酸的序列如SEQ ID No.2所示。

所述注射是将纯化后的可溶性G蛋白与完全弗氏佐剂乳化后，皮下多点免疫于新西兰雄兔，10天后进行第二次免疫，以后每隔一周加强免疫，加强免疫采用与不完全弗氏佐剂乳化，大腿肌肉注射方法。