[发明专利]一种适用于EB病毒DNA提取的方法及提取试剂盒

说明书

本发明涉及一种适用于EB病毒DNA提取的方法及提取试剂盒，所述方法将血液离心分离成上清血浆、中间白细胞层和下层红细胞层，然后分别处理后再进行裂解，采用吸附柱提取并收集得到DNA溶液。本发明的有益效果：本发明通过核酸释放剂裂解细胞，释放核酸，利用硅胶膜在高盐低pH会选择性的吸附核酸，在低盐高pH时，释放核酸的特性，达到纯化核酸的目的；提取的DNA纯度更高，含量更高，且DNA的完整性较好，基本上没有降解；通过本发明的提取方法进行提取纯化得到的EB病毒DNA的定量更加全面与准确。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种适用于EB病毒DNA提取的方法及提取试剂盒。

背景技术

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是疱疹病毒科嗜淋巴细胞病毒属的成员，基因组为DNA。EB病毒具有在体内外专一性地感染人类及某些灵长类B细胞的生物学特性。EB病毒在口咽部上皮细胞内增殖，然后感染B淋巴细胞，这些细胞大量进入血液循环而造成全身性感染，在增殖和血液循环过程中会将EB病毒的基因组释放到续血液中，现有的针对EB病毒核酸提取的方法大多都是只提取白细胞中的核酸或血清或血浆中的核酸，或者，只单一的针对外周血中的白细胞、血清或血浆中的EB病毒的提取，导致整个EB病毒DNA拷贝数的定量存在一定的误差，导致后续的诊断存在偏差，可能会错过预防与治疗的最佳时机。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种适用于EB病毒DNA提取的方法及提取试剂盒，本方法通过对血液中白细胞、血清或血浆中游离的DNA进行提取纯化，使EB病毒核酸定量更全面、更准确。

本发明的目的是提供一种适用于EB病毒DNA提取的方法。

本发明的再一目的是提供上述适用于EB病毒DNA提取的方法所用的试剂盒。

根据本发明的具体实施方式的适用于EB病毒DNA提取的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)样品前处理：抽取2ml血液样品，注入到抗凝管中，立即颠倒混匀；离心后分离上清液得到上清血浆和下层物质，向所述上清血浆中加入裂解液Ⅰ和Proteinase K，混合均匀后温育消化，形成上清待提取液；向所述下层物质中加入红细胞裂解液，静置裂解后离心分离，弃去上清，然后用PBS洗去红色沉淀，剩余的白色沉淀用裂解液Ⅰ悬浮，温育消化，形成沉淀待提取液；

(2)裂解：将步骤(1)得到的所述上清待提取液和所述沉淀待提取液混合后加入裂解液Ⅱ，震荡混匀后离心，取上清液加入异丙醇，混合均匀，转移到已装入收集管的吸附柱中，吸附并离心后，取出所述吸附柱，倒掉所述收集管中的废液，并将所述吸附柱放回所述收集管中；

(3)DNA溶液收集：用洗涤液对步骤(2)所述收集管中的吸附柱进行洗涤，离心后弃去废液；再用无水乙醇进行洗涤，离心后弃去废液；将所述吸附柱进行继续离心后弃去废液，然后晾干；最后在吸附柱中间部位加入洗脱液或灭菌水室温孵育，离心后收集DNA溶液即可。

根据本发明的具体实施方式的适用于EB病毒DNA提取的方法，其中，+步骤(1)中，所述血液样品经4500rpm离心5分钟后，分离上清液得到上清血浆和下层物质；所述裂解液Ⅰ的添加量为160ul/200ul所述上清血浆；所述Proteinase K的添加量为20ul/200ul所述上清血浆；所述Proteinase K的浓度为20mg/ml。

根据本发明的具体实施方式的适用于EB病毒DNA提取的方法，其中，步骤(1)中，向所述上清血浆中加入裂解液Ⅰ和Proteinase K，混合均匀后60℃温育消化30分钟，消化完成后形成上清待提取液；向所述下层物质中加入等体积的红细胞裂解液，静置裂解30分钟后，1600rpm离心1分钟后分离，弃去上清；剩余的白色沉淀用裂解液Ⅰ悬浮，60℃温育消化30分钟，形成沉淀待提取液。可以用PBS洗涤数次，直至红色沉淀去除干净。温育消化时可以颠倒2-3次，使混匀并充分消化。