[发明专利]一种调控转录激活因子以降低黄酒酵母尿素积累的方法

说明书

本发明公开了一种调控转录激活因子以降低黄酒酵母尿素积累的方法，属于遗传工程领域。本发明是以重组黄酒酵母JNZ01(MATa,Δura3,Δtrp1,TOR1S1972R,Δfpr1)作为出发菌株，在基因组上融合表达GLN3、FKBP12或GAT1、FKBP12，并在质粒上融合表达SPT15、FRB，通过添加雷帕霉素，使FKBP12和FRB结合。在此基础上，Gln3和Gat1在细胞核定位蛋白Spt15的作用下，转移到细胞核，激活尿素利用相关基因的转录，使发酵过程中尿素的积累分别降低49.45％和38.98％，分别降低到8.25mg/L和9.95mg/L。

技术领域

一种调控转录激活因子以降低黄酒酵母尿素积累的方法，属于遗传工程领域。

背景技术

酿酒酵母对氮源的利用存在偏好性，优先利用偏好型氮源(如谷氨酰胺、谷氨酸等)，对非偏好型氮源(如尿素、脯氨酸等)的利用滞后，这种现象被称为氮代谢物阻遏效应。调控因子Gln3和Gat1是酿酒酵母氮代谢阻遏效应全局调控因子之一，对氮源利用相关基因其转录激活作用。在偏好型氮源存在的情况下，Gln3和Gat1定位于细胞质，无法进入细胞核激活非偏好型氮源利用相关基因的表达，导致非偏好型氮源利用被抑制，最终在发酵体系中积累。

黄酒发酵过程中，酿酒酵母发挥主要作用。受氮代谢物阻遏效应的影响，在黄酒发酵过程中，尿素利用滞后，最终在发酵体系中积累。积累的尿素会与体系中乙醇发生自发反应，生成2A类潜在致癌物质氨基甲酸乙酯，严重影响黄酒产品的安全性。因此通过调控转录激活因子定位于细胞核，可以有效减弱氮代谢阻遏效应对尿素利用的抑制作用，降低发酵过程中尿素的积累，提高黄酒产品的品质。

发明内容

本发明提供了一种降低黄酒酵母尿素积累的方法，所述方法通过调控转录激活因子定位于细胞核，调控氮代谢阻遏效应转录激活因子不受氮源条件影响，降低黄酒酵母发酵过程中尿素的积累。

在本发明的一种实施方式中，所述转录激活因子包括但不限于Gln3、Gat1。

本发明的第二个目的是提供一种构建尿素积累能力降低的黄酒酵母的方法，所述方法是在重组黄酒酵母JNZ01 (MATa, Δura3, Δtrp1, TOR1S1972R, Δfpr1)的基因组上融合表达GLN3、FKBP12或GAT1、FKBP12，并在质粒上融合表达SPT15、FRB，并通过在含雷帕霉素的体系中培养，使FKBP12和FRB结合使Gln3和Gat1在细胞核定位蛋白Spt15的作用下转移到细胞核。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：

（1）构建GLN3、FKBP12和GAT1、FKBP12重组框；

（2）将GLN3、FKBP12和GAT1、FKBP12重组框分别整合到重组黄酒酵母JNZ01(MATa,Δura3, Δtrp1, TOR1S1972R, Δfpr1)基因组上GLN3和GAT1基因之后；

（3）消除CRISPR-Cas9系统质粒，得到重组黄酒酵母JNZ02和JNZ03；

（4）构建SPT15、FRB融合表达框；