[发明专利]一种基于巢式PCR的检测沙门氏菌的引物组、用途、包含该引物组的试剂盒及其检测方法在审
| 申请号： | 201811445329.3 | 申请日： | 2018-11-29 |
| 公开（公告）号： | CN109251990A | 公开（公告）日： | 2019-01-22 |
| 发明（设计）人： | 王红宁;梅雪然;翟熙雯;雷昌伟;叶晓兰 | 申请（专利权）人： | 四川大学 |
| 主分类号： | C12Q1/689 | 分类号： | C12Q1/689;C12Q1/6848;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/42 |
| 代理公司： | 成都顶峰专利事务所(普通合伙) 51224 | 代理人： | 李永生 |
| 地址： | 610000 四川*** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 引物组 沙门氏菌 检测 核苷酸序列 巢式PCR 试剂盒 试剂盒特异性 复杂样品 两对引物 细菌检测 可检测 灵敏度 内引物 外引物 制备 灵敏 应用 | ||
1.一种基于巢式PCR的检测沙门氏菌的引物组，其特征在于：所述引物组包括两对引物，其中外引物为F1和R1，内引物为F2和R2，所述F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.一种检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物组、PCR扩增试剂、阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品为沙门氏菌标准株基因组DNA，所述阴性质控品为双蒸水。
3.根据权利要求2所述的用于检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增试剂为浓度为2×的PCR MIX。
4.一种用权利要求2或3所述的试剂盒检测沙门氏菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)准备待测DNA样品：提取待测样本的DNA；
(2)配制三组PCR的反应液：包括检测组、阴性对照组和阳性对照组，三组PCR的反应液中均包括PCR扩增试剂、模板一、双蒸水和权利要求1中所述的外引物，所述检测组、阳性对照组和阴性对照组的模板一分别依次为待测DNA样品、阳性质控品和双蒸水；
(3)首轮PCR反应：将步骤(2)中配制好的三组PCR反应液分别离心混匀，进行首轮PCR，分别得到三组PCR反应液一；
(4)配制第二轮PCR的反应液：所述检测组、阳性对照组和阴性对照组的第二轮PCR的反应液包括PCR扩增试剂、模板二、双蒸水和权利要求1中所述的内引物，所述检测组、阳性对照组和阴性对照组中的模板二分别依次为所述检测组、阳性对照组和阴性对照组的PCR反应液一稀释后的PCR反应液；
(5)第二轮PCR反应：将步骤(4)中配制好的第二轮PCR的反应液分别离心混匀，进行第二轮PCR，分别得到三组PCR反应液二；
(6)检测：将三组PCR反应液二分别检测，判断结果。
5.根据权利要求4所述的检测沙门氏菌的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中首轮PCR的反应条件中退火温度为60℃，延伸时间为45s，循环数为35个循环。
6.根据权利要求5所述的检测沙门氏菌的方法，其特征在于：所述步骤(5)中第二轮PCR的反应条件中退火温度为65℃，延伸时间为15s，循环数为35个循环。
7.根据权利要求6所述的检测沙门氏菌的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中首轮PCR和步骤(4)中第二轮PCR的PCR反应液的体积均为25μL；每组PCR反应液中各组分的加样量为，2×的PCR MIX为12.5μL，10μmol/L的F1或F2各1μL，10μmol/L的R1或R2各1μL，模板为1μL，余量用双蒸水补齐。
8.根据权利要求4所述的检测沙门氏菌的方法，其特征在于：所述模板二由PCR反应液一稀释100倍制备而成。
9.一种权利要求1所述的引物组在检测沙门氏菌或制备检测沙门氏菌的试剂盒中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述引物组用于制备检测沙门氏菌的试剂盒。
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