[发明专利]生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法及其应用

权利要求书

1.牛磺鹅去氧胆酸生物转化为牛磺熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：

制备方法的步骤为基因密码子优化、工程菌构建、工程菌培养、底物转化及产物制备；

(1)基因密码子优化

对基因序列进行大肠杆菌表达密码子优化，加入亲和标签，并进行全基因合成，分别记为7α-类固醇脱氢酶基因7α-HSDH、乳酸脱氢酶基因LDH、7β-类固醇脱氢酶基因7β-HSDH、葡萄糖脱氢酶基因GDH；

所述7α-类固醇脱氢酶的DNA序列为SEQ ID NO:1，7α-类固醇脱氢酶的蛋白质序列为SEQ ID NO:2，乳酸脱氢酶的DNA序列为SEQ ID NO:3，乳酸脱氢酶的蛋白质序列为SEQ IDNO:4，7β-类固醇脱氢酶DNA序列为SEQ ID NO:5，7β-类固醇脱氢酶蛋白质序列为SEQ IDNO:6，葡萄糖脱氢酶的DNA序列为SEQ ID NO:7，葡萄糖脱氢酶的蛋白质序列为SEQ ID NO:8；

(2)单基因表达载体构建

将7α-HSDH、LDH、7β-HSDH和GDH分别构建至pETDuet-1载体中，得pETDuet-1-7α-HSDH，pETDuet-1-LDH，pETDuet-1-7β-HSDH，pETDuet-1-GDH；

(3)双基因表达载体构建

将7α-HSDH和LDH，7β-HSDH和GDH分别构建至pETDuet-1载体中，得pETDuet-1-7α-HSDH/LDH，pETDuet-1-7β-HSDH/GDH；

(4)单基因融合蛋白表达载体构建

将7α-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因，7β-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因分别构建至pETDuet-1载体中，得pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)，pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)；

(5)单基因融合蛋白与脱氢酶共表达载体构建

将7α-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因与乳酸脱氢酶单基因，7β-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因与葡萄糖脱氢酶单基因分别构建至pETDuet-1载体中，得pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/LDH，pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/GDH；

(6)单基因融合蛋白与类固醇脱氢酶共表达载体构建

将7α-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因与7α-类固醇脱氢酶单基因，7β-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因与7β-类固醇脱氢酶单基因分别构建至pETDuet-1载体中，得pETDuet-1-(LDH-Linker-7α-HSDH)/7α-HSDH，pETDuet-1-(GDH-Linker-7β-HSDH)/7β-HSDH；

(7)工程菌构建

将步骤(2)-步骤(6)构建的所有表达载体分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，得到工程菌；

(8)工程菌小量发酵表达

工程菌菌液涂布氨苄抗性的LB平板，挑选单克隆，接种至5mL含有氨苄的LB培养基中，37℃，220rpm，进行培养，OD值为0.8-1.2时，加入1mM IPTG诱导2h，SDS-PAGE检测表达量，选取表达量高的克隆，进行菌种保藏；

20μL菌种接种至200mL氨苄抗性LB培养基中过夜培养，OD值为2.5-4.0，取2mL培养液接种至氨苄抗性培养基中培养，OD值为1时，加入IPTG诱导过夜表达，收集菌体；

(9)工程菌大量发酵表达

挑选工程菌接种至氨苄抗性LB培养基的1L三角瓶中，37℃，220rpm过夜培养，OD600值为2.5-4.0，各取20mL培养液接种至含有10个1L氨苄抗性培养基的3L三角瓶中，37℃，140rpm过夜培养；将10L种子液无菌接种至装有200L大肠杆菌高密度发酵培养基的发酵罐中，37℃，通气搅拌培养8小时，通气搅拌培养8小时后，向发酵罐中加入终浓度为0.1mM的IPTG溶液进行诱导，诱导10-12h后发酵结束，放液，离心收集菌体并4℃保存，取少量菌体重悬于100mM磷酸盐缓冲液中，超声破碎，得到粗酶液；

(10)酶活力测定

7α-类固醇脱氢酶的酶活测定方法：以牛磺鹅去氧胆酸为底物，在一个3mL的反应体系中加入2.97mL的100mM pH8.0磷酸缓冲液，终浓度0.5mM的牛磺鹅去氧胆酸，10μL的稀释酶液，终浓度0.5mM的NADP + ，在pH8.0和25℃反应1min，在340nm处测定吸光值增加；

乳酸脱氢酶的酶活测定方法：以丙酮酸钠为底物，在一个3mL的反应体系中加入2.7mL的100mM磷酸缓冲液，pH8.0，0.2mL的100mM丙酮酸钠，50μL的稀释酶液，NADH终浓度为0.2mM，在pH8.0和25℃反应1min，在340nm处测定吸光值减少；

7β-类固醇脱氢酶的酶活测定方法：以牛磺熊去氧胆酸为底物，在一个3mL的反应体系中加入2.97mL的100mM磷酸缓冲液，pH8.0，终浓度0.5mM的牛磺熊去氧胆酸，10μL的稀释酶液，终浓度0.5mM的NADP + ，在pH8.0和25℃反应1min，在340nm处测定吸光值增加；

葡萄糖脱氢酶的酶活测定方法：以葡萄糖为底物，在一个3mL的反应体系中加入2.7mL的100mM磷酸缓冲液，pH8.0，0.2mL的1.5M葡萄糖，50μL的稀释酶液，NADP + 终浓度为2mM，在pH8.0和25℃反应2min，在340nm处测定吸光值增加；

(11)牛磺鹅去氧胆酸转化为牛磺熊去氧胆酸

将牛磺鹅去氧胆酸溶解于20-100mM甘氨酸缓冲液中，加入0.01-0.8mM的NAD + ，加入5-60g/L的丙酮酸钠，加入表达7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的大肠杆菌菌体，补加20-100mM甘氨酸缓冲液至最终体积，用氢氧化钠调节pH至6.5-8.5，25℃，反应6-18h；加入1.8-100g/L的葡萄糖，加入表达7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌菌体，用氢氧化钠调节pH至6.5-8.5，25℃，反应6-18h；

(12)牛磺熊去氧胆酸的制备

将步骤(11)转化完成的反应液，旋蒸至膏状，加入2-10倍的无水乙醇或95％乙醇，离心或过滤去除沉淀，上清液经干燥即得牛磺熊去氧胆酸粗品，把牛磺熊去氧胆酸粗品，使用乙腈溶解，0.22um滤膜过滤除去不溶物形成上柱液；将所述上柱液使用制备型高效液相制备设备注入装填硅胶层析填料的高压不锈钢柱中；然后使用不同浓度甲醇-水流动相进行逐步洗脱，将收集的洗脱液倒入旋转蒸发仪内进行旋转蒸发至粘稠状，同时回收甲醇；然后置于真空干燥箱内干燥，采用高效液相色谱法测定样品中牛磺熊去氧胆酸的纯度。