[发明专利]生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法及其应用

说明书

本发明公开了生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法及其应用，生物转化法包括基因密码子优化、工程菌构建、工程菌培养、底物转化及产物制备；采用工程菌直接发酵转化底物制备牛磺熊去氧胆酸，底物为牛磺鹅去氧胆酸。底物浓度可高达250g/L，反应时间短，对底物的转化率高达98％以上，所获得的产品纯度在99％以上；反应体系中NAD⁺循环再生，极大降低了辅酶NAD⁺的使用量，酶催化反应的成本降低，利于工业放大；将类固醇脱氢酶和辅酶再生酶通过柔性多肽序列连接在一起构建成融合蛋白多聚体，与底物和辅酶的结合距离更近，更有利于转化反应的进行，在工业化生产中，减少发酵的次数，简化了工艺，节约时间成本和原料成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种采用基因工程手段对生物酶进行改造后，高效催化牛磺鹅去氧胆酸生物转化的方法，具体为生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法及其应用。

背景技术

牛磺熊去氧胆酸，化学名称为3α,7β-二羟基胆烷酰-N-牛磺酸，具有解痉、抗惊厥、抗炎及溶胆石等作用。牛磺熊去氧胆酸主要是存在于黑熊胆汁中，是熊胆中标志性有效成分。2007年，商品名为滔罗特的牛磺熊去氧胆酸胶囊，获准在中国销售。其主要用于溶解胆固醇结石。熊去氧胆酸，是亲水性的胆汁酸，溶石率有限，安全性好，副作用较少，已被广泛用于临床。牛磺熊去氧胆酸，是熊去氧胆酸与牛磺酸的共轭体，与熊去氧胆酸相比，亲水性更强，溶石速度更快，安全性更好。

牛磺鹅去氧胆酸，广泛存在于鸡、鸭、鹅等禽畜胆汁中，与牛磺熊去氧胆酸是7位羟基上的差向异构体。

起初，牛磺熊去氧胆酸是从“人工引流”的黑熊胆汁中提取的，来源有限，收率低，批次间差异大，对动物不人道。后来，逐渐被人工合成方法所取代。人工化学合成方法，主要分为三类：一是通过形成活性中间体如混合酸酐、活性硫酯等，再与牛磺酸钠反应；二是在缩合剂作用下形成酰胺；三是通过胱胺类物质形成酰硫化物再氧化得到目的产物。这些方法选择性低，使用大量有机试剂，污染环境。

为了解决“人工引流”熊胆汁提取和人工化学合成方法的缺陷，逐渐发展出用生物转化的方法制备牛磺熊去氧胆酸。中国发明专利CN102994604A公开了一种通过7α-类固醇脱氢酶和7β-类固醇脱氢酶两步催化，将牛磺鹅去氧胆酸转化为牛磺熊去氧胆酸的方法。此种方法中，底物浓度较低(50g/L)，底物转化不完全，需要使用大量成本昂贵的辅酶，反应中间体牛磺7-酮石胆酸作为副产物难以去除。中国发明专利CN107287272A公开了一种制备牛磺熊去氧胆酸的方法。其分别构建含有7α-类固醇脱氢酶和7β-类固醇脱氢酶的表达载体或二者的共表达载体，在培养基中加入底物，发酵的同时进行转化，将牛磺鹅去氧胆酸转化为牛磺熊去氧胆酸。但此种方法底物浓度低、转化率低，反应中间体牛磺7-酮石胆酸含量高，转化周期长，不易进行工业化生产。

发明内容

本发明的目的是：为了克服现有技术中的不足之处，提供生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法及其应用，特别是创造性的将类固醇脱氢酶和辅酶再生酶通过柔性多肽序列连接在一起构建成融合蛋白多聚体，与底物和辅酶的结合距离更近，更有利于转化反应的进行，能够实现高收率、高纯度牛磺熊去氧胆酸的制备。

技术方案：生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法，生物转化法包括基因密码子优化、工程菌构建、工程菌培养、底物转化及产物制备；采用工程菌直接发酵转化底物制备牛磺熊去氧胆酸，底物为牛磺鹅去氧胆酸；所述工程菌是表达7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶单表达酶，或7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶共表达酶，或7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶双四聚体融合酶，或7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶双四聚体融合酶与乳酸脱氢酶共表达酶，或7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶双四聚体融合酶与7α-类固醇脱氢酶共表达酶；或者，7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶单表达酶，或7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶共表达酶，或7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶四聚体融合酶，或7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶四聚体融合酶与葡萄糖脱氢酶共表达酶，或7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶四聚体融合酶与7β-类固醇脱氢酶共表达酶的大肠杆菌。