[发明专利]一种核桃组织培养再生体系构建方法

说明书

本发明公开了一种核桃组织培养再生体系构建方法，核桃又名为胡桃，是世界四大坚果之一。主产欧州、亚州等国，核桃称益智果、长寿果，养人之宝，已经为越来越多人所推崇。核桃的药用价值很高，中医应用广泛。医学认为核桃性温、味甘、无毒，有健胃、补血、润肺、养神等功用。通过无性快繁技术获得株性稳定核桃种苗的技术方法。本发明以核桃未成熟胚为外植体，经过种子消毒、胚愈伤组织诱导、分化培养、生根培养、炼苗及移栽等步骤构建了核桃组织培养再生体系，既解决核桃优质种苗缺乏的问题，又可为今后开展核桃遗传转化工作奠定基础。

技术领域

本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种核桃组织培养再生体系构建方法。

背景技术

核桃又名为胡桃，是世界四大坚果之一。主产欧州、亚州等国，核桃称益智果、长寿果，养人之宝，已经为越来越多人所推崇。核桃的药用价值很高，中医应用广泛。医学认为核桃性温、味甘、无毒，有健胃、补血、润肺、养神等功用。核桃为常规核桃育种技术具有局限性，如远缘杂交困难、有益突变频率低、选育优良品种耗时长、花期不遇等，制约了优质资源的利用，使得品种选育工作难以取得突破性的进展。而植物组织培养技术具有加速育种进程、缩短繁殖时间、改良植物品质、节省空间、减少劳动、可终年生产、不受自然条件限制等特点，可有效解决品种选育耗时长的问题。近年来核桃组织培养研究方面取得了一定的进展，但依然存在一些问题，如外植体褐化现象严重、出梢率低、生根困难、移栽大田成活率低等，使组织培养技术在核桃中的应用受到很大的限制。因此，非常有必要建立系统的离体快繁体系，为今后对核桃进行品质遗传改良奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供出一种核桃组织培养再生体系构建方法，本发明以核桃未成熟胚为外植体，经过种子消毒、胚愈伤组织诱导、分化培养、生根培养、炼苗及移栽等步骤构建了核桃组织培养再生体系，从而实现了本发明的目的。

本发明的一种核桃组织培养再生体系构建方法，包括以下的步骤：

步骤1，种子消毒：选择未成熟果子，去叶后于洗衣粉水浸泡42min，刷净后自来水冲洗2h，取出尚未成熟的乳白或略带棕色的种子，在超净工作台中，剥开外种皮，先用75%乙醇消毒36s后用无菌水洗10次，再用0.1%升汞溶液消毒32min，用无菌水冲洗10次后备用；

步骤2，胚愈伤组织诱导：将经步骤（1）处理后未成熟种胚切成0.5cm×0.5cm×0.5cm接种到诱导培养基上,先在25～28℃条件下全暗培养48天，然后置于每天光照16小时，光照强度为3200lx，直至诱导形成胚性愈伤组织；诱导培养基为：ER+6-BA6mg/L+NAA1.5mg/L+GA₃7 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.2g/L，pH为5.8；

步骤3，分化培养：将步骤（2）培养获得的呈绿色的子叶愈伤组织转入分化培养基上进行分化培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养18天，然后置于每天光照16小时，光照强度为5600lx，置于培养温度为25～28℃的条件下培养直至形成丛生芽；分化培养基为：ER+6-BA5.2mg/L+IBA1.5mg/L+蔗糖35g/L+琼脂7.2g/L，pH为5.8；

步骤4,生根培养：将步骤（3）过程获得的高度约为4.5cm的丛生芽分切接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养15天，然后置于每天光照16小时，光照强度为3500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养至生根；生根培养基为：1/2MS+IBA1.2mg/L+GGR2.2mg/L+KT3.2mg/L+蔗糖35g/L+琼脂7.2g/L，pH为5.8。

步骤5，炼苗移栽：将步骤（4）获得的高约12cm的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗10天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由泥炭土和粘土混合成的基质中并定植于大田中。