[发明专利]黑色食物小分子肽在修复肝损伤中的医用用途

权利要求书

1. 一种AtD-SAT转基因酵母菌株，基因序列如SEQ No.1所示。

2. 如权利要求1所述的一种AtD-SAT转基因酵母菌株的制备方法制备，包括以下步骤：

1） 总RNA 提取和反转录

以Total RNA 提取试剂RNAiso Plus 提取AtD-SAT酵母的总RNA，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性后，利用核酸定量仪测定其浓度和纯度，取1 μ g 总RNA，以AOLP 为引物：5'- GGCCACGCGTCGACTAGTACT16 （G/A/C）- 3' 反转录合成cDNA；

2） 基因克隆、重组表达载体的构建及电转化

根据酵母转录组序列信息，设计特异引物DBTN F：AGCAATGGTG GAAGAGTAAA，以cDNA 为模板进行扩增；根据酵母AtD-SAT基因编码成熟肽序列设计引物，在引物5' 端分别引入酶切位点Eco RI 和Xba I；

上游引物P1 ：5'- CGGGAATTCATGTCGTGTGAAGAACTG - 3'；

下游引物P2 ：5'- CTAGTCTGAGGATCCCATCCCCATACTC - 3' ；

以酵母的cDNA 为模板，以引物P1 和P2 进行目的片段的PCR 扩增，回收目的片段后用Eco RI 和Xba I 进行双酶切；将双酶切后的目的片段连接至经Eco RI 和Xba I双酶切后的pPICZ-DSAT载体，将其转化大肠杆菌感受态Trans- T- 1 中，筛选阳性克隆；将表达载体pPICZ-DSAT用Sac I 线性化后电转化入毕赤酵母感受态中，平行设置pPICZ-DSAT载体为对照；电转化后将转化子涂布在MD 平板上，所含物质的质量浓度分别为无氨基酸酵母氮源基础培养基YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg/L、葡萄糖20 g/L、琼脂15 g/L，将平板置于30℃培养箱培养，直至出现单个菌落，此菌落即为目标酵母菌——AtD-SAT酵母菌株；

3） 遗传霉素筛选及PCR

鉴定转化子 利用无菌水重悬酵母重组子，将酵母重组子分别涂布于含有不同遗传霉素浓度（0、0.25、0.5、1、2、3、4 mg/mL）的YPD 平板上；所含物质的质量浓度分别为酵母粉10g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂15 g/L，于30℃培养；待不同遗传霉素条件下长出单克隆菌落后，在对应的遗传霉素条件下进行划线培养；挑取菌落为模板，以P1和P2，pPICZ-DSAT 载体上的5' AOX1（5'- GACTGGTTCCAATTGACAAGC- 3'）和P2 为引物，分别进行PCR 扩增鉴定各转化子插入情况；

4） 重组pPICZ-DSAT的诱导表达、蛋白检测及分离纯化

将阳性重组子置于BMGY 培养基中；所含物质的质量浓度分别为酵母粉10 g/L、蛋白胨20g/L、磷酸钾缓冲液（pH 6.0）100mL/L、YNB13.4g/L、生物素0.4 mg/L、甘油10 mL/L；在30℃200 r/min 条件下培养，当OD 600 =0.4~0.8 时收集菌体并重悬于BMMY 培养基中：所含物质的质量浓度分别为酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、磷酸钾缓冲液（pH6.0）100 mL/L、YNB13.4 g/L、生物素0.4 mg/L、甲醇5 mL/L；于30℃下200 r/min 培养，每间隔24 h添加无水甲醇，使其终浓度为0.5%；

诱导96 h 后收集发酵上清液进行Tricine- SDS- PAGE 分析，并以抗His 标签兔多克隆抗体为一抗，以山羊抗兔抗体为二抗对表达产物进行Western Blot 检测；按照His 标签蛋白纯化试剂说明书对带有6×His 标签的小分子肽进行纯化，并用牛血清蛋白BSA 作为对照，Bradford 法测定蛋白的浓度。

3.如权利要求1所述的一种AtD-SAT转基因酵母菌株在制备黑色食物小分子肽中的用途。

4. 一种丝氨酸乙酰转移酶，氨基酸序列如SEQ No.2所示。

5.一种黑色食物小分子肽，其特征在于：是由上述的AtD-SAT转基因酵母菌株发酵所得，主要活性成分为含有权利要求4所述的一种丝氨酸乙酰转移酶。

6.一种黑色食物小分子肽的制备方法，包括以下步骤：

1）称量黑芝麻 10-15份、黑米10-15份、黑豆20-30份、黑枸杞1-5份、花生20-30份、黑木耳5-10份和黑桑葚10-15份以流动的水洗净，并破壁研磨，加入30-40份白糖后迅速倒入发酵罐中；

2）向发酵罐中加总物料体积3.5－4倍的无菌水，用消毒后搅拌均匀；

3）25-30摄氏度条件下，加入权利要求1所述的AtD-SAT转基因酵母菌株0.02-0.03份密封3天进行发酵；

4）步骤3）中的发酵液温度升至55-65℃，加入木瓜蛋白酶0.02-0.03份， pH6.0－7.0，反应18－24h；

5）分别装入离心筒中离心，3000－5000r/min，20-30min，将上清和沉淀分别保存，取上清即得。