[发明专利]炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.用于炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测的特异性引物和探针，其特征在于，包括炭疽杆菌BA5345基因的正向引物BA5345-F、反向引物BA5345-R和探针BA5345-P；和炭疽杆菌PA基因的正向引物PA-F、反向引物PA-R和探针PA-P，所述的引物和探针的核苷酸序列如下所示：

引物BA5345-F：5'-ATGGGGATACCAGGATGGGT-3'；

引物BA5345-R：5'-GCATTACATACCCCAAAGGT-3'；

探针BA5345-P：

5'-FAM-TCCAAACCCCAATGACCAGAG-TAMRA-3'；和

引物PA-F：5'-TGGTGGGAGTGTATCTGCAGGA-3'；

引物PA-R：5'-GTAGATTGGAGCCGTCCCAG-3'；

探针PA-P：5'-VIC-TCTTGAACCCGACTTTGTTACC-TAMRA-3'。

2.一种炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于包括：

荧光定量PCR反应液；

权利要求1所述的引物BA5345-F、引物BA5345-R、探针BA5345-P和引物PA-F、引物PA-R、探针PA-P；

阳性对照：所述阳性对照为含有炭疽杆菌BA5345基因或其片段的重组质粒pUC57-BA5345和含有炭疽杆菌PA基因或其片段的重组质粒pUC57-PA；和

阴性对照。

3.如权利要求2所述的炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR反应液为2×TaqMan Universal Master Mix。

4.如权利要求2所述的炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有510bp的BA5345基因片段的pUC57-BA5345重组质粒和含有1406bp的PA基因片段的pUC57-PA重组质粒。

5.如权利要求2所述的炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为去离子水。

6.一种炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：

用权利要求2所述引物和探针对所述阳性对照和阴性对照进行双重荧光定量PCR，并建立所述阳性对照和阴性对照的荧光定量PCR扩增曲线；

测定所述阳性对照的D_260nm值和D_280nm值，用权利要求2所述的引物和探针对D_260nm/D_280nm值在1.8-2.0之间的阳性对照进行双重荧光定量PCR，制作所述阳性对照的双重荧光定量PCR扩增标准曲线；

用权利要求2所述的引物和探针对待测样品的DNA进行双重荧光定量PCR，并建立所述待测样品的荧光定量PCR扩增曲线；和

通过比较所述PCR扩增曲线，判断所述待测样品中是否存在炭疽杆菌BA5345和PA基因，若存在则表示所述待测样品中存在炭疽杆菌。

7.如权利要求6所述的炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述双重荧光定量PCR的反应体系为：2×TaqMan Universal Master Mix，12.5mL；20pmol/μL的正向引物BA5345-F和PA-F，各0.5μL；20pmol/μL的反向引物BA5345-R和PA-R，各0.5μL；10.0pmol/μL的探针BA5345-P和PA-P，各0.5μL；DNA模板2.0μL；ddH₂O 7.5μL，总体积25μL。

8.根据权利要求6所述的炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述双重荧光定量PCR的反应条件为：预变性处理为95℃，10mins；然后PCR反应操作40个循环：变性处理95℃，15s，退火/延伸/收集荧光信号处理60℃，60s。

9.如权利要求6所述的炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述方法还包括，如果存在炭疽杆菌，则可以根据PA基因的扩增情况，判断炭疽杆菌的毒力。