[发明专利]炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明属于基因检测技术领域，提供了一种用于炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测的特异性引物和探针，包括炭疽杆菌BA5345基因的正向引物BA5345‑F、反向引物BA5345‑R和探针BA5345‑P；和炭疽杆菌PA基因的正向引物PA‑F、反向引物PA‑R和探针PA‑P。本发明还提供了包含所述引物和探针的检测试剂盒，以及利用双重荧光定量PCR检测炭疽杆菌的方法。本发明的试剂盒和方法可以准确、简便、高效、快速地检测炭疽杆菌。

技术领域

本发明属于基因检测领域，更具体而言涉及炭疽杆菌的荧光定量PCR检测。

背景技术

炭疽杆菌(Bacillus anthracis)是一种革兰氏阳性芽孢杆菌，可引起人畜共患的炭疽病，是世界动物卫生组织(OIE)确立的必须通报的动物疫病。炭疽杆菌抵抗力强，形成芽孢后可在动物皮毛和土壤等环境中长期存在。炭疽杆菌具有高致病性，对人和动物的健康和生命构成极大威胁，常被用作生物恐怖战剂，其快速而精确的诊断一直备受重视。炭疽杆菌诊断的金标准是分离到炭疽杆菌，但传统的检测方法耗时较长，难以适应疫情控制的需要。

炭疽杆菌与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、蕈状芽孢杆菌(B.mycoides)和魏氏芽孢杆菌(B.pseudomycoides)等具有相同的形态及生化特征，均属于蜡样芽孢杆菌群。细菌的高度相似性导致了在适当的温度、湿度和pH值条件下物种之间基因水平转移的可能性，基因转移导致了诊断困难。大多数诊断方法，包括OIE推荐的炭疽杆菌PCR方法，都以毒力因子pXO1和pXO2质粒上的基因片段为检测对象，通过检测毒力因子判断是否检出炭疽杆菌。但是由于基因转移现象的存在，即使PCR方法也很难将炭疽杆菌和其他蜡样芽孢杆菌区分开来，经常出现交叉反应。

近年来本发明人所在的课题组发现，在皮毛炭疽监测中，OIE推荐的PCR诊断方法中的引物可与蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌发生交叉反应，给炭疽诊断带来困扰。因此，仅仅基于炭疽杆菌毒力因子质粒的分子鉴定是不够的，还需要新的检测方法。

由此可见，本领域急需一种新的炭疽杆菌基因检测方法，其可以消除炭疽杆菌与其他蜡样芽孢杆菌的PCR交叉反应，快速、稳定和准确地检测炭疽杆菌，同时可以判定毒力。

发明内容

为了解决现有技术的缺陷及不足，本发明提供了一种炭疽杆菌双重荧光定量PCR特异性引物和探针及检测试剂盒，并建立一种简便、高效、实用的炭疽杆菌基因检测方法。该方法可用于炭疽杆菌的快速检测及强弱毒株的区分，应用前景广阔。

在本发明的一个方面中，本发明提供了一种用于炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测的特异性引物和探针，包括炭疽杆菌BA5345基因的正向引物BA5345-F、反向引物BA5345-R和探针BA5345-P；和炭疽杆菌PA基因的正向引物PA-F、反向引物PA-R和探针PA-P，所述的引物和探针的核苷酸序列如下所示：

引物BA5345-F：5'-ATGGGGATACCAGGATGGGT-3'；

引物BA5345-R：5'-GCATTACATACCCCAAAGGT-3'；

探针BA5345-P：

5'-FAM-TCCAAACCCCAATGACCAGAG-TAMRA-3'；和

引物PA-F：5'-TGGTGGGAGTGTATCTGCAGGA-3'；

引物PA-R：5'-GTAGATTGGAGCCGTCCCAG-3'；

探针PA-P：5'-VIC-TCTTGAACCCGACTTTGTTACC-TAMRA-3'。

在本发明的第二方面中，本发明提供了一种炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测试剂盒，其包括：

荧光定量PCR反应液；