[发明专利]一种NK细胞和γδT细胞共培养的建立方法

说明书

本发明涉及一种细胞培养技术领域，尤指一种NK细胞和γδT细胞能够体外共同扩增培养的一种NK细胞和γδT细胞共培养的建立方法，主要包括：S1、试剂选择；S2、通过培养基对PBMC培养，时间为3天；S3、增补培养基，维持浓度并培养4天；S4、第7天后离心弃上清然后转至T25细胞培养瓶中，后更换EX培养基；S5、第10天后增补培养基维持浓度；S6、第12天后继续增补培养基维持浓度；S7、第14天后检测NK及γδT细胞比例及细胞总数；本发明的共培养建立方法，一次性的培养出两种具有类似性质的抗肿瘤免疫细胞，提高细胞培养效率，相较于独立独立培养各种免疫细胞获得ＮＫ细胞和γδT细胞而言可大幅度降低培养成本，也降低了培养技术难度。

技术领域

本发明涉及一种细胞培养技术领域，尤指一种NK细胞和γδT细胞能够体外共同扩增培养的一种NK细胞和γδT细胞共培养的建立方法。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，与抗肿瘤免疫技术密切相关，首先体外培养NK细胞然后自体回输可以作为肿瘤治疗的辅助细胞治疗应用；NK细胞体外培养是这种细胞治疗的关键环节，且NK细胞具有IL-2中亲和性受体，在IL-2刺激下可发生增殖反应，现有NK细胞体外培养主要通过添加含有IL-2的培养基扩增而来，目前有比较多的商用培养基供选择。

γδT细胞是执行固有免疫功能的T细胞，其TCR由γ和δ链组成，γδT细胞是一种既能杀伤癌细胞、肿瘤干细胞，又能识别癌抗原的免疫细胞；现有研究表明γδT细胞的一个亚型可以在磷脂分子的刺激下快速激活增殖，而该亚型γδT细胞自体回输也可以作为肿瘤治疗的辅助治疗应用，通过磷脂分子体外扩增γδT细胞技术具有重要的临床价值；目前用于γδT细胞扩增的商用培养基选择不多，通常用Ｔ细胞培养基添加磷脂分子来获得γδT细胞。

γδT细胞和NK细胞都具有肿瘤细胞杀伤活性，都能够用于肿瘤病人的辅助治疗，如果可以同步扩增这两种细胞并应用于病人将具有重要意义，然而目前还没有能能够同步扩增两种细胞的方法建立，目前NK细胞和γδT细胞的体外扩增培养均单独进行，同步扩增培养的建立方法仍待研发，其意义价值亦仍待验证。

发明内容

为解决上述问题，本发明旨在公开一种细胞培养技术领域，尤指一种NK细胞和γδT细胞能够体外共同扩增培养的一种NK细胞和γδT细胞共培养的建立方法，从而实现同步培养NK细胞和γδT细胞的体外培养目的。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种NK细胞和γδT细胞共培养的建立方法，其特征在于，所述的建立方法包括：

S1、试剂准备包括：IL2细胞因子、AlyS505NK-AC培养基、EX培养基、HMBPP抗原、CD3抗体、CD56抗体、γ9抗体和PBMC外周血单个核细胞；

S2、选用12孔板，将每毫升1.5×10⁶个PBMC外周血单个核细胞的细胞放置于孔板内；依次加入无血清AlyS505NK-AC培养基激活、IL2细胞因子和HMBPP抗原；培养观察3天；

S3、第3天，在12孔板中增补2mL无血清AlyS505NK-AC培养基、IL2细胞因子和HMBPP抗原，使得最终浓度与原始浓度相同，总体积为3mL，然后培养箱中培养4天；

S4、第7天后，对细胞进行500g速度离心，离心5min后弃上清，然后将12孔板中的细胞分别转至T25细胞培养瓶中，再然后，更换5mL EX培养基进行扩增培养：依次加入无血清EX培养基、IL2细胞因子和HMBPP抗原；

S5、第10天后，在T25细胞培养瓶中增补5mL无血清EX培养基、IL2细胞因子和HMBPP抗原，使得最终浓度与原始浓度一致，总体积为10mL；

S6、第12天后，继续增补10 mL无血清EX培养基、IL2细胞因子和HMBPP抗原，使得最终浓度与原始浓度一致，总体积为20mL；