[发明专利]一种检测硝基还原酶的荧光探针及其制备方法与酶促反应的应用

说明书

本发明公开了一种检测硝基还原酶的荧光探针及其制备方法与酶促反应的应用，属于工业分析检测技术领域。所述荧光探针为3‑(4‑(2‑(4'‑(二苯胺基)‑3‑((4‑硝基苄基)氧基)‑[1,1'‑联苯基]‑4‑基)乙烯基)喹啉‑1‑溴)丙烷‑1‑磺酸盐。本发明的探针化合物通过引入亲水性基团磺酸根和喹啉盐类增强其亲水性，在硝基还原酶（NTR）的催化下发生1,6‑重排和消除反应，生成羟基，通过分子内电荷转移效应（ICT）引发的荧光变化来实现对酶促反应中NTR的检测分析。该方法具有制备简便、产率较高、且适用于检测酶促反应中高浓度酶含量等优点，在化工领域中的酶促反应体系酶检测领域显示了极大的应用前景。

技术领域

本发明属于工业分析检测技术领域，具体涉及一种检测硝基还原酶的荧光探针及其制备方法与酶促反应的应用。

背景技术

硝基化合物广泛应用于医药、染料、农药和炸药等行业，但是它们大多数对人类有致癌作用，会引起诸多疾病，危害人类健康。而胺类化合物在农药、医药、染料、合成树脂、表面活性剂等诸多精细化工产品和中间体的合成中至关重要，因为，氨基的引入使得精细化学品功能的变化成为可能，例如氨基的引入可以使化合物的吸收和发射光谱红移，在染料生色基团的邻位引入氨基可以导致染料的颜色变化，氨基的引入可以改变染料的印染性能；更重要的是，和硝基化合物相比，胺类化合物毒性较小。目前，工业上大部分芳胺化合物都是经由芳香族硝基化合物还原制得，所以，硝基还原成氨基这一类反应在工业生产中有重要作用。

通常，工业上的主要还原方法是铁粉还原、硫化碱还原和催化加氢还原法等。但这些方法存在工艺流程复杂、后处理麻烦、过程中产生诸多废弃物、制备费用高昂等缺点。近年来，用生物方法将硝基化合物还原成氨基化合物发展迅速，成为构建环境友好的绿色化学的方法之一。酶，又称为酵素，是具有生物催化功能的生物大分子，是一类生物催化剂。绝大多数酶都是蛋白质，其具有较好的生物相容性和环境友好性。酶催化可以看作是介于均相和非均相催化反应之间的一种催化，既具有一般催化剂的特征，也具有不同于一般催化剂的特殊性。相比于一般催化剂，酶催化剂具有诸多优点：1)酶促反应具有很高的效率；2)酶促反应具有高度的专一性；3)酶促反应较为温和；4)酶的种类的多样性，使得酶促反应的多样性；5)可以通过调节酶的活性，进而调节酶促反应的效果。但由于大多数酶本身为蛋白质，其容易被反应过程中的温度、酸碱度、被催化物的浓度等影响其活性甚至失活。因此，酶促反应应尽可能在水相中进行，有利于减少有机溶剂对环境的污染且利于酶促反应的进行。

近些年，随着酶分离纯化技术的提高，用游离酶直接作用于硝基化合物的还原成为生物有机化学中的一个崭新领域，其中氧化还原酶催化还原硝基化合物是研究的热点。目前主要用于此类酶促反应的氧化还原酶主要有硝基还原酶、硝酸还原酶等。其中，硝基还原酶是一类应用相对广泛的酶，且其来源广泛易得，酶促作用条件温和，酶促反应效果较好，对其研究比较深入，作用机理相对成熟，同时其具有对氧敏感和对氧不敏感的两种酶类型，应用范围广泛。因此，为了能够保证酶促反应在工业应用中的硝基类化合物转换成胺类化合物的高效性和稳定性，研究和开发能够测量此类硝基还原酶的荧光探针具有重要意义。

荧光法在分析检测上具有选择性佳、灵敏度高、响应速度快和使用方便等优异特点。同时，荧光化合物在化学结构上易于设计、修饰和改进，能满足不同检测样品的需要；因此，荧光法非常适合工业上酶促反应中硝基还原酶的分析检测。中国专利CN201610050741.X制备了一种用于检测缺氧区硝基还原酶的双光子荧光探针，该化合物中的芳香硝基能够被硝基还原酶还原成芳胺基，并引发1,6-重排与消除反应，释放出荧光主体，导致荧光发生变化，但是该荧光探针水溶性一般，且具有聚集诱导淬灭的性质，难以实现高浓度和水相中的酶检测分析，同时使用双光子检测设备复杂且昂贵，应用领域主要集中于细胞中的缺氧区。中国专利CN201610471060.0公开了一种可以检测硝基还原酶的双光子荧光探针，将硝基直接接在荧光主体上，随着硝基还原酶浓度的增加，荧光强度逐渐增强，发射波长范围在425-475nm和500-550nm之间，该探针不利于在水相中使用，在高浓度的硝基还原酶存在时容易发生荧光淬灭，且主要应用于生物领域的细胞成像，不具备大规模工业酶促反应的应用潜质。