[发明专利]甘薯SPVD病毒重组双CP融合蛋白、由其制备的多克隆抗体、其制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种甘薯SPVD病毒重组双CP融合蛋白、由其制备的多克隆抗体、其制备方法及其应用，属于生物技术领域。本发明的甘薯SPVD病毒重组双CP融合蛋白，是由甘薯褪绿矮化病毒和甘薯羽状斑驳病毒CP基因的融合片段构建到重组表达载体，转化表达菌株，诱导表达得到。并将制备的甘薯SPVD病毒重组双CP融合蛋白免疫兔，获得的抗血清即为甘薯SPVD病毒重组双CP多克隆抗体。本发明通过制备甘薯SPVD病毒重组双CP多克隆抗体，可同时检测甘薯褪绿矮化病毒和羽状斑驳病毒，提高了检测效率，降低了检测成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种甘薯SPVD病毒重组双CP融合蛋白、由其制备的多克隆抗体、其制备方法及其应用。

背景技术

甘薯是我国重要的粮食、饲料、工业原料及新型能源作物。病毒病是甘薯上的重要病害，是导致甘薯产量降低、品质下降和种性退化的主要原因之一。由于长期的无性繁殖，病毒可通过薯块和秧苗传播，同时对甘薯病毒缺乏有效的化学防治方法，甘薯病毒病成为困扰甘薯产业发展的难题。

目前已报道侵染甘薯的病毒有30余种，其中由甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)和甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)协生共侵染引起的甘薯病毒病(Sweetpotato virus disease，SPVD)是甘薯上最严重的病毒病之一。感染SPVD后，甘薯表现叶片扭曲、畸形、褪绿、明脉以及植株矮化等症状，产量损失可达70％以上，甚至绝收。2009年，我国首次发现SPVD病毒，短短几年时间在我国三大薯区均有SPVD发生，并且迅速蔓延。2014年SPVD和卷叶病毒在甘薯生产上大爆发，山东、河南、江西、湖北、重庆、安徽等地的上万亩甘薯田发病严重，发病田块产量损失达60％～80％。我国甘薯上的SPCSV存在东非和西非2个株系，其中西非株系分布范围更广，为我国的优势株系。

目前对甘薯病毒尚无有效的化学防治方法，采用茎尖组织培养，结合病毒检测技术以及利用无病毒种植材料，能有效地恢复品种优良种性、增强抗性、提高产量和改善品质、延长种薯的服务期限，增产幅度达20％～40％。但培养的脱毒苗需要进行病毒检测，才能服务于农户。目前，脱毒苗病毒检测的常用方法是ELISA法，有些研究组也制备了单种病毒重组 CP多克隆抗体，这种方法只用于单种病毒的检测，成本高，效率低。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种甘薯SPVD病毒重组双CP融合蛋白以及由其制备的多克隆抗体，同时用于两种病毒的ELISA检测，提高检测效率，降低检验成本。

为了达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种甘薯SPVD病毒重组双CP融合蛋白，是由甘薯褪绿矮化病毒和甘薯羽状斑驳病毒 CP基因的融合片段构建到重组表达载体，转化表达菌株，诱导表达得到。

在上述方案的基础上，所述甘薯褪绿矮化病毒和甘薯羽状斑驳病毒CP基因的融合片段的核酸序列如SEQ ID No:1所示。

在上述方案的基础上，所述融合蛋白序列如SEQ ID No:2所示。

在上述方案的基础上，所述甘薯SPVD病毒重组双CP融合蛋白的制备方法，步骤如下：

(1)重组表达载体的构建：在甘薯褪绿矮化病毒和甘薯羽状斑驳病毒CP基因的融合片段两端分别加上Nde Ⅰ和HindⅢ的酶切接头，酶切后，连接到原核表达载体pET22b，得到重组表达载体；

(2)转化表达菌株：将重组表达载体转化Rosetta(DE3)感受态细胞；

(3)诱导表达：挑取(2)中阳性克隆，诱导表达融合蛋白；

(4)融合蛋白纯化：采用镍离子亲和层析纯化融合蛋白。

在上述方案的基础上，所述诱导表达条件为：IPTG添加终浓度为0.5mM，诱导温度20℃，转速220rpm，诱导过夜。