[发明专利]特异性识别水稻黑条矮缩病毒p10蛋白的核酸适配体及其筛选方法和用途

权利要求书

1.一种核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列包含TGACACCGTACCTGCTCT(N)_XAAGCACGCCAGGGACTAT，其中，N为核糖核苷酸或脱氧核苷酸，优选为G、T、A或C，X为50-100之间，优选为60-90，最优选为80的自然数。

2.如权利要求1所述的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列选自SEQ ID NO.:6-29中的一个；更优选地，所述核酸适配体的核苷酸序列为SEQ ID NO.:6、11、13、15、16、19、21、22或24；最优选地，所述核酸适配体的核苷酸序列为SEQ ID NO.:16。

3.如权利要求1或2所述的核酸适配体，其中所述核酸适配体与一种或多种选自荧光分子、放射性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、酶标记和毒素分子的物质连接。

4.如权利要求1至3中任一项所述的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列包括在其一个或多个位置处的磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化和/或同位素化。

5.一种核酸适配体的筛选方法，该筛选方法包括以下步骤：

(1)将靶物质固定于固相载体；

(2)制备单链核酸文库；

(3)将变性后的单链核酸文库和固定于载体的靶物质在溶液中混合，分离未结合的单链核酸与载体-靶物质-单链核酸复合体；

(4)通过洗脱将载体-靶物质-单链核酸复合体中的单链核酸分离；

(5)将分离的单链核酸加入水油混合物，通过匀浆制成水油乳浊液，进行隔离式ePCR扩增；

(6)采用有机溶剂破坏乳浊液，回收水相中的双链核酸分子；

(7)测定ePCR回收产物的产量，依其判定执行下一轮筛选、重复本轮筛选或执行等比放大扩增；

任选地，以后筛选轮次中的单链核酸文库为上一轮ePCR回收产物形成的单链核酸文库；

优选地，所述核酸适配体为DNA；

在步骤(1)中，优选地，所述靶物质为肽；更优选地，所述肽具有连续六个组氨酸序列；优选地，所述肽为病毒外壳蛋白；优选地，所述病毒为水稻黑条矮缩病毒；优选地，所述病毒外壳蛋白为水稻黑条矮缩病毒p10蛋白；

在步骤(1)中，优选地，所述固相载体为镍离子包被的磁珠；

在步骤(3)中，优选地，所述分离采用离心管磁力架；

在步骤(5)中，优选地，所述匀浆为室温条件下30赫兹振荡10秒；

在步骤(6)中，优选地，所述有机溶剂为水饱和仲丁醇或无水仲丁醇。

6.如权利要求5所述的筛选方法，所述筛选方法还包括重复步骤(1)至(7)一次或多次，其中将上一轮筛选回收的部分双链核酸分子制备成单链核酸，作为下一轮筛选的单链核酸文库；优选地，所述重复为5-9次。

7.如权利要求5或6所述的筛选方法，所述筛选方法还包括反向筛选；优选地，所述反向筛选采用无靶物质的载体分离去除文库中亲和结合固相载体的核酸分子；更优选地，反向筛选工序仅在第7轮和第9轮筛选之前进行。

8.如权利要求5至7中任一项所述的筛选方法，在步骤(7)中，所述判定包括分别将ePCR回收产物的产量与安全值和预警值进行比较；优选地，若ePCR回收产物的产量大于等于安全值，则执行下一轮筛选；若ePCR回收产物的产量大于等于预警值且小于安全值，则重复本轮筛选；若ePCR回收产物的产量小于预警值，则执行等比放大扩增；优选地，所述安全值为3微克；优选地，所述预警值为1微克；

优选地，所述执行下一轮筛选是指所述筛选条件相对上一轮筛选条件改变的筛选；优选地，所述筛选条件的改变是指所述筛选条件中一个或多个的改变，所述筛选条件选自：本轮使用的核酸文库总质量、靶物质-载体复合物总量、结合静置时间、清洗次数、清洗所用体积和ePCR循环数中的一个或多个；优选地，各轮筛选条件设置的如下表所示：