[发明专利]特异性识别水稻黑条矮缩病毒p10蛋白的核酸适配体及其筛选方法和用途

说明书

本发明提供了一种特异性识别水稻黑条矮缩病毒p10蛋白的核酸适配体及其筛选方法和用途。本发明通过一种快速有效的DNA核酸适配体筛选方法，获得了特异性识别水稻矮缩病毒p10蛋白的核酸适配体及其用途。采用本发明的方法能够减少筛选轮数，缩短筛选时间，能够去除结合到载体上的非特异性核酸适配体，能够筛选出高亲和力核酸适配体，特别是DNA核酸适配体，能够调整多个参数逐步增加筛选过程的严格程度，能够监控核酸适配体的多样性程度和各链丰度。基于特异性结合水稻黑条矮缩病毒p10蛋白的核酸适配体可以简易快捷地进行病毒检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种快速有效的DNA核酸适配体筛选方法、一种特异性识别水稻矮缩病毒p10蛋白的核酸适配体及其用途。

背景技术

水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus，RBSDV)为呼肠孤病毒科斐济病毒属成员，由介体昆虫灰飞虱传播，广泛侵染水稻、玉米、小麦、大麦、高粱、燕麦等禾本科植物，在水稻中引起水稻黑条矮缩病，在玉米中引起玉米粗缩病。水稻在被RBSDV侵染后表现出矮缩、叶色加深、叶脉出现瘤状凸起等症状。RBSDV在水稻和玉米的整个生育期均可侵染，幼苗期侵染直接导致植株不能抽穗，水稻分蘖期感染RBSDV，虽能抽穗但往往形成包穗，难以结实。近年来RBSDV引起的病毒病对我国的粮食生产造成了严重威胁。

针对水稻黑条矮缩病毒的鉴定，目前主要的方法为蛋白质印迹法、酶联免疫吸附测定法、免疫荧光标记法、实时荧光定量PCR法和电镜观察法。前三种方法均基于水稻黑条矮缩病毒编码的蛋白的特异性抗体。然而抗体的制备步骤繁琐，需要使用单克隆杂交瘤细胞注射小鼠腹水，因此抗体不同的批次间存在差异，带来了检测质量的不稳定，存在检测准确度易变化等问题。此外，抗体的检测技术还存在对抗体的保存要求高，样品前处理步骤复杂，病毒检测依赖诸多实验室设备等不便利因素。实时荧光定量PCR和电镜观察法对设备的要求更高，样品前处理的步骤更为复杂。基于以上情况，水稻黑条矮缩病毒的检测目前无法实现在采样当地进行快速检测，而需要将样品运送至各省市的农业科学研究院或植物保护站进行，导致效率较低，且结果滞后，不利于病害的及时监测。

水稻黑条矮缩病毒粒子结构为正二十面体，由双层病毒衣壳构成。由病毒S10基因编码的p10蛋白为该病毒外壳蛋白的主要结构组份，是检测病毒粒子的最优靶分子。

核酸适配体作为一种合成的短单链寡核苷酸，主要分为DNA核酸适配体和RNA核酸适配体。核酸适配体通过自身折叠形成茎环、假结、G4链体等空间结构，经过指数富集的配体进化系统(SELEX)筛选后，可以高亲和力、高特异性地识别靶标分子，近年来成为抗体替代分子的首选。核酸适配体具有多种特性使它优于单克隆抗体。例如，核酸适配体通常分子质量较小(8-25kDa)，具有较小的空间位阻，所以可以快速穿透阻碍并定位到靶物质。另外，核酸适配体绝大多数没有免疫原性，化学性质稳定，易于合成和修饰，可被开发成为廉价的快速检测试剂盒。当前核酸适配体作为新一类分子被广泛用于检测、诊断、药物开发和治疗中，具有极大的科研开发潜力和商业价值。