[发明专利]一种聚半乳糖醛酸酶编码基因及酶和制备与应用

说明书

本发明公开了一种来源于黑曲霉菌(Aspergillus parasiticus)的聚半乳糖醛酸酶基因及其酶的制备方法与应用，即利用基因工程的技术方法，将该聚半乳糖醛酸酶的基因克隆到毕赤酵母表达载体上，获得可异源高表达该酶的毕赤酵母重组菌株，该菌株能够直接高效降解富含果胶的水果皮，从而获得果胶寡糖；该菌株异源表达制备的聚半乳糖醛酸酶，能高效降解果胶多糖，能高效降解不同来源和酯化度的商业化果胶和聚半乳糖醛酸。本发明提供的聚半乳糖醛酸酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加剂、医药及寡聚半乳糖醛酸和不同聚合度半乳糖醛酸标准品制备等领域。

技术领域

本发明涉及一种聚半乳糖醛酸酶的基因序列及其制备方法和应用。本发明提供了该聚半乳糖醛酸酶的重组质粒和重组基因工程菌株及其在多糖降解方面的应用。本发明提供的聚半乳糖醛酸酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药及果胶寡糖和不同聚合度半乳糖醛酸标准品制备等领域。

背景技术

果胶(Pectin)是植物细胞壁中结构和功能最为复杂的多糖，广泛存在于自然界中；果胶以果胶，果胶酸，原果胶三种形态分布在植物的软组织细胞壁，细胞间层，细胞与次生壁连接区等；果胶多糖是一种高分子化合物，平均分子量介于20000～400000之间。果胶多糖的结构十分复杂，主要包括同聚半乳糖醛酸(Homogalacturonan，HG)，约占果胶的65％；鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I(Rhamnogalacturonan-I，RG-I)，约占果胶的20％～35％；鼠李糖半乳糖醛酸聚糖II(Rhamnogalacturonan-II，RG-II)三部分，约占果胶的10％。果胶的主要结构是半乳糖醛酸在α-1,4糖苷键的作用下线性聚合而成，是果胶的HG部分，也就是聚半乳糖醛酸(PGA)。根据果胶酯化度的大小将果胶分为低甲氧基果胶(LM)与高甲氧基果胶(HM)；低酯果胶根据是否酰胺化又可分为普通低酯果胶和酰胺化低酯果胶，根据果胶的凝结速率将高酯果胶分为快凝果胶，中凝果胶，慢凝果胶，三者之间的区别在于其酯化程度，分别为高于70％，介于65％～70％之间，低于65％。

果胶寡糖又称寡聚半乳糖醛酸，是由果胶多糖降解而成的一种酸性寡糖。寡聚半乳糖醛酸不仅具有普通寡糖的生物功效，如抑制病原菌、增强机体的免疫功能，改善脂类代谢，改善动物肠道与胃中的微生物区系，降低血清中胆固醇含量，改善动物生产性能，防止便秘、腹湾，降低血压等，还可激活植物的自卫系统，对植物起到抗病、防病和提高生长速度等功效。由果胶降解得到的寡聚半乳糖酸酸已经被证实在植物中有一系列的生物活性，如能够诱导植物抗病性防御反应，调节植物生长发育及细胞表面的快速反应。在大肠和结肠中，微生物降解果胶寡糖释放出对健康产生积极影响的短链脂肪酸(益生元效应)。

果胶的基本组成单位是半乳糖醛酸，而果胶在自然界分布广泛，丰富的原料来源是酶解果胶生产寡聚半乳糖醛酸的最显著优势。目前制备寡聚半乳糖醛酸的方法大多是用果胶酶来水解果胶或果胶酸，得到不同聚合度的寡聚半乳糖醛酸的混合物。酶法制备寡聚半乳糖醛酸具有反应重复性好、条件温和、产物分离纯化过程简单、所得到的寡聚半乳糖醛酸品质优良等特点。同时利用酶解果胶多糖的方法获得，酶的反应效率高，方法简单、易控制，后期分离也容易，且酶作为一种生物制剂，不会带来化学试剂产生的不利因素。所以利用酶解果胶多糖的方法生产寡聚半乳糖醛酸是一条相对简单，容易研究的生产方法。

聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase)是果胶酶系中研究最为广泛的酶种，属于糖苷水解酶第28家族，特异催化水解多聚半乳糖醛酸链中α-1,4-糖苷键产生单个或寡聚的半乳糖醛酸，与其他糖苷水解酶一样，聚半乳糖醛酸酶有内切酶(endo-)和外切酶(exo-)之分，内切聚半乳糖醛酸酶的水解产物是寡聚半乳糖醛酸。

聚半乳糖醛酸酶参与果胶的降解，使细胞壁结构解体，聚半乳糖醛酸酶在果汁、果泥、果酒等果蔬的生产加工和生产果胶寡糖等方面具有较大的应用价值和前景。因此，寻找一种能够高效、稳定降解果胶多糖的聚半乳糖醛酸酶是获得果胶寡糖和不同聚合度半乳糖醛酸标准品和制剂的有效途径。而由于聚半乳糖醛酸酶在生物体内的含量非常少，借助基因水平进行高量表达和表征是提聚半乳糖醛酸酶产量的一种最有效措施。