[发明专利]一种海洋放线菌液体发酵产物提取复合物及其制备方法和应用

权利要求书

1.海洋放线菌液体发酵产物提取复合物在抑制金黄色葡萄球菌生长中的应用，其特征在于，所述提取复合物从海洋放线菌F8的液体发酵产物中提取；所述海洋放线菌为灰略红链霉菌(streptomyces griseorubens)F8，于2017年11月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC No.14923；

所述海洋放线菌发酵所用培养基和种子液培养基的pH均为7.5-8，121℃灭菌20min；均由以下组分组成：KNO₃ 1g，K₂HPO₄ 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.5，自然海水1L；

所述的提取复合物的提取方法，采用以下步骤：

(1)发酵液的制备

将菌株接种到种子液培养基中，于25-30℃、180-250r/min条件下摇瓶培养2-3d，获得种子液；将种子液以8％的接种量接种到培养基中，在25-30℃、180-250r/min条件下培养8-11d获得发酵液；

(2)粗提物的获得

将步骤(1)制备的发酵液真空旋转蒸发浓缩至发酵液体积的1/10，用等体积的氯仿反复萃取浓缩液去掉氯仿层留下水层，将水层进行层析，然后进行梯度洗脱，收集100％甲醇洗脱液，真空旋转蒸发至干，得粗品；

(3)复合物的制备

将步骤(2)制备的粗品溶解到超纯水中进行葡聚糖凝胶G-25层析，在316min时出现单峰并对此峰进行收集，将收集液冷冻干燥得到复合物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述的层析为：先将水层进行732阳离子交换树脂层析，再进行AB-8大孔树脂层析。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述层析的具体操作为称取200g的732阳离子交换树脂放到层析柱中，先用2L的超纯水平衡层析柱，然后将水层缓慢地加入到层析柱中，调节流速5-10滴/s收集流出液；将收集的流出液进行AB-8大孔树脂层析：称取100gAB-8树脂于层析柱中，用2L超纯水平衡层析柱，然后将样品缓慢地加入到层析柱中。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述梯度洗脱具体的操作为用超纯水、10％甲醇、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇进行梯度洗脱。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述葡聚糖凝胶G-25层析，所用到的仪器为HP PLUS 10D蛋白纯化仪，所述蛋白仪具体操作参数为：

(1)平衡：平衡2个柱体积，流速设置为5mL/min；

(2)进样：进样2mL，流速设置为0.5mL/min；

(3)洗脱：洗脱3个柱体积，流速设置为0.5mL/min；

(4)冲洗：冲洗3个柱体积，流速设置为5mL/min。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具体方法如下：

(1)将金黄色葡萄球菌预先活化两代后再接种到液体培养基中，在37℃条件下培养6-8h，作为测试菌菌液；

(2)用复合物配制溶液装入试管；

(3)在步骤(2)制备复合物溶液试管中，加入步骤(1)制备的测试菌0.2ml，充分混匀，另做两个对照管；其中所述对照管一个只含复合物不含测试菌，另一个对照管只含测试菌不含复合物；

(4)将步骤(3)所述的试管均置于37℃恒温箱中培养24h，取出试管，充分振荡，用肉眼观察各试管的浑浊度，如某管培养液与对照管一同样透明，则表明测试菌的生长被抑制。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述液体培养基为pH 7.4-7.6，121℃灭菌20min；由以下重量组分的原料组成：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母浸粉5g，蒸馏水1L。