[发明专利]猕猴桃愈伤组织原生质体制备方法

说明书

本发明提供猕猴桃愈伤组织原生质体制备方法，步骤包括：(1)培养愈伤组织，培养基为以MS为基础培养基，添加6‑BA，NAA，蔗糖和琼脂，并调节pH为5.7‑5.8，培养温度为23‑26℃，光照强度为1000‑1500lx，光照时间为16h/d；(2)对愈伤组织用0.3‑0.7mol·L^‑1甘露醇进行预处理，预处理时间为0＜t≤90min；(3)再将愈伤组织放入酶解液进行酶解；(4)将酶解所得的混合液过滤，收集滤液并离心；取沉淀重悬，再次离心并弃去上清液，对沉淀洗涤即得原生质体。通过对愈伤组织培养条件的调整得到适宜的愈伤组织，此外通过甘露醇对愈伤组织进行预处理，提高原生质体的分裂频率，进而使原生质体的活力和产量都有所提高，本发明通过酶的种类、浓度、酶解时间、温度、pH、渗透剂等的配合，使特定愈伤组织得到的原生质体数量最多，且活力良好。

技术领域

本发明涉及植物组织提取培养领域，具体涉及猕猴桃愈伤组织的原生质体的分离提取方法。

背景技术

猕猴桃为猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia)的落叶类木质藤本植物，多数是雌雄异株，极少数是雌雄同株。全世界猕猴桃分布于从马来西亚至西伯利亚东部的广阔地带，目前有猕猴桃属66种，其中62个种原产我国，我国是猕猴桃的的原生中心，湖北宜昌市夷陵区雾渡河镇是世界猕猴桃的原产地。猕猴桃具有较高的营养价值，有消炎、抗肿瘤等药用价值，还可以加工成果汁等可以长时间贮藏的食物。

植物原生质体因其失去细胞壁，可以作为基础研究及作物改良的理想材料，因此原生质体培养是猕猴桃育种的重要手段。原生质体通常从愈伤组织中提取分离而得，对于愈伤组织的形态、原生质体的分离纯化等条件均有进一步优化的空间。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种优化的猕猴桃愈伤组织原生质体的提取分离方法，对特定形态愈伤组织的处理方式、酶解液等分离条件进行调整，使该愈伤组织提取得到的原生质体数量更多。

本发明的技术方案是提供一种猕猴桃愈伤组织原生质体制备方法，包括如下步骤：

(1)培养愈伤组织，培养基为以MS为基础培养基，添加0.5-1.5mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)，0.05-0.5mg/L NAA(萘乙酸)，25-35g/L蔗糖和5-9g/L琼脂，并调节pH为5.7-5.8，培养温度为23-26℃，光照强度为1000-1500lx，光照时间为16h/d；

(2)对步骤(1)所得的愈伤组织用0.3-0.7mol·L^-1甘露醇进行预处理，预处理时间为0＜t≤90min；

(3)将步骤(2)所得的愈伤组织放入酶解液进行酶解；

(4)将酶解所得的混合液过滤，收集滤液并离心；取沉淀重悬，再次离心并弃去上清液，对沉淀洗涤即得原生质体。

进一步地，上述步骤(1)中，添加物质浓度优选为0.5mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA，30g/L蔗糖和7g/L琼脂。在该浓度下，所得的愈伤组织为浅绿色，质地较致密，块状有少数颗粒凸起，其分离原生质体效果最好。

进一步地，上述步骤(2)中，预处理条件优选为甘露醇浓度0.7mol·L^-1，处理时间60min，甘露醇作为渗透剂对猕猴桃愈伤组织进行预处理，使愈伤组织能够迅速适应后续步骤的渗透压，有利于分离操作。

进一步地，上述步骤(3)中，酶解液的组成为甘露醇0.3-0.7mol·L^-1，纤维素酶0.5-2.5％，果胶酶0.1-0.5％，离析酶0.25-1.25％(纤维素酶、果胶酶、离析酶的浓度均指质量浓度)。

进一步地，上述步骤(3)中，酶解液的组成为甘露醇0.7mol·L^-1，纤维素酶1.0％，果胶酶0.1％，离析酶1.25％(纤维素酶、果胶酶、离析酶的浓度均指质量浓度)。