[发明专利]一种高产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法

说明书

本发明公开了一种高产L‑赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法，属于遗传工程技术领域。本发明是以谷氨酸棒杆菌CICC 23604作为出发菌株，采用CRISPR‑Cas9基因编辑技术，异源表达来源于丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum ATCC824)的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC，提高胞内NADPH供给；敲除高丝氨酸激酶编码基因thrB，减少发酵过程副产物苏氨酸的积累，得到积累L‑赖氨酸的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，产量达到42g/L，为进一步代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产L‑赖氨酸奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌及其构建方法，属于遗传工程技术领域。

背景技术

L-赖氨酸是八大必需氨基酸之一，是人和动物必需的、自身不能合成的氨基酸。L-赖氨酸具有平衡氨基酸组成、调节体内代谢平衡、提高机体对谷类蛋白质的吸收及利用率和促进机体生长发育等功能，因此被广泛应用于饲料、医药及食品工业中。

目前，L-赖氨酸生产主要有化学合成法、蛋白水解法和微生物发酵法，其中微生物发酵法生产成本低、生产强度高、对环境污染小，因而成为目前工业生产L-赖氨酸应用最广泛的方法。目前生产L-赖氨酸的常用菌株包括大肠杆菌、黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌，其中谷氨酸棒杆菌为食品安全级菌株，但其在摇瓶水平的L-赖氨酸产量一直未得到大幅提升。

谷氨酸棒杆菌CICC 23604已经被广泛应用于工业发酵生产各类氨基酸，其产品被FDA 认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组谷氨酸棒杆菌是生产食品安全级L-赖氨酸的有效途径。目前，利用表达质粒介导的氨基酸合成途径中关键性酶基因的过表达是对谷氨酸棒杆菌进行基因改造的主要手段。然而利用表达质粒介导基因过表达必将在谷氨酸棒杆菌细胞内引入抗生素抗性基因并在生长过程中添加一定的抗生素，引起人们对抗生素使用的疑虑。因此，提供一种安全高效的对谷氨酸棒杆菌进行遗传改造的方法，对于生产食品安全级L-赖氨酸有重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种产L-赖氨酸的重组谷氨酸棒杆菌，引入了外源的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC，并敲除了谷氨酸棒杆菌基因组上高丝氨酸激酶编码基因thrB。

在本发明的一种实施方式中，所述的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示，是在丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824来源的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的核苷酸序列的基础上，进行了密码子优化。

在本发明的一种实施方式中，所述高丝氨酸激酶编码基因thrB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，以谷氨酸棒杆菌CICC 23604为出发菌株。

在本发明的一种实施方式中，在NCgl1144基因的启动子下游引入了磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC。

本发明的第二个目的是提供上述的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)构建磷酸甘油醛脱氢酶重组片段以及高丝氨酸激酶敲除片段：合成外源的磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapC，与位点上下游同源臂片段融合得到片段GA1，合成内源高丝氨酸激酶编码基因thrB上下游同源臂片段融合得到片段TH2；

(2)构建重组质粒：分别将GA1和TH2与含有sgRNA的线性化载体连接，分别得到含GA1的重组质粒和含TH2的重组质粒；