[发明专利]一种高产L-色氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法

权利要求书

1.一种产L-色氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于，替换了莽草酸激酶基因aroK启动子为T7启动子，敲除了色氨酸转运体编码基因mtr并替换了预苯酸脱氢酶编码基因pheA的启动子为tac启动子；所述的tac启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，是对大肠杆菌CICC 10303进行基因组编辑得到的。

3.如权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述基因组编辑是利用CRISPR-Cas9技术进行的。

4.权利要求1-3任一所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)构建T7启动子替换重组片段、tac启动子替换重组片段以及敲除mtr基因重组片段：将大肠杆菌莽草酸激酶编码基因aroK基因簇起始密码子上下游同源臂序列融合后，引入T7启动子，得到重组片段T7AROK；将预苯酸脱氢酶编码基因pheA的起始密码子上下游同源臂序列融合后，引入启动子tac，得到片段TACPHE；将色氨酸转运体编码基因mtr上下游同源臂融合，得到片段MTRD。

2)构建重组质粒：将片段T7AROK、TACPHE、MTRD分别与含有sgRNA的线性化载体连接，分别得到重组质粒含T7AROK的重组质粒、含TACPHE的重组质粒、含MTRD的重组质粒；

3)构建重组大肠杆菌：将含有cas9蛋白的质粒转化大肠杆菌CICC 10303，得到大肠杆菌CICC 10303-cas9；随后将含T7AROK的重组质粒转化大肠杆菌CICC 10303-cas9，得到重组大肠杆菌CICC 10303-aroKT；将含TACPHE的重组质粒转化大肠杆菌CICC 10303-aroKT，得到重组大肠杆菌CICC 10303-pheAT；将含MTRD的重组质粒转化大肠杆菌CICC 10303-pheAT，得到重组大肠杆菌CICC 10303-mtrD；去除外源质粒后，得到重组大肠杆菌CICC10303-TRYP。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述含有cas9蛋白的质粒是pCas9。

6.如权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于，所述含T7AROK的重组质粒序列如SEQID NO.5所示，所述含TACPHE的重组质粒序列SEQ ID NO.6，所述含MTRD的重组质粒序列如SEQ ID NO.7所示。

7.权利要求1-3任一所述的重组大肠杆菌在生产L-色氨酸中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括将平板培养基中34-38℃下培养22-26h的单菌落接种至种子培养基，于34-38℃、180-220rpm条件下培养5-8h，再以20％的接种量接种发酵培养基，34-38℃、180-220rpm条件下培养10-14h，0.1mM IPTG诱导45-50h。

9.权利要求1-3任一所述的重组大肠杆菌在饲料、制药、保健品或食品工业生产L-色氨酸中的应用。