[发明专利]一种高产L-色氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法

说明书

本发明公开了一种高产L‑色氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法，属于遗传工程技术领域。本发明是以大肠杆菌CICC 10303作为出发菌株，采用CRISPR‑Cas9基因编辑技术，替换莽草酸激酶编码基因aroK启动子为强启动子T7；替换预苯酸脱氢酶编码基因pheA的启动子为弱启动子tac；敲除色氨酸转运体编码基因mtr，阻止发酵过程色氨酸转运回胞内。最终得到积累L‑色氨酸的大肠杆菌基因工程菌，产量达到36g/L，为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产L‑色氨酸奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种高产L-色氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法，属于遗传工程技术领域。

背景技术

L-色氨酸作为一种非常重要的芳香性氨基酸，是人体必需的八种氨基酸之一。在生物体内，L-色氨酸可以合成5-羟基色胺、烟酸、色素、生物碱、辅酶、吲哚乙酸等重要的生物活性物质，对人和动物的生长发育起重要作用，广泛应用于食品、医药、饲料等方面。L-色氨酸的生产最早主要依靠化学合成法和蛋白质水解法，但是这些方法存在着材料来源有限、周期长、工艺复杂等缺点，因而逐渐被淘汰。由于成本低廉、原料来源广泛、环境污染小等特点，微生物法生产L-色氨酸已经得到了广泛的应用。

目前，微生物法生产L-色氨酸存在产量不高、操作复杂等缺点。2001年，王健等用硫酸二乙酯(DES)作为诱变剂，选取了一株酪氨酸、苯丙氨酸双营养缺陷株出发菌株，经过多次诱变处理之后，选育出一株L-色氨酸生产菌株，分批连续发酵64h后，L-色氨酸积累量可以达到7.28g/L。2007年，陈俊峰等利用多次诱变的分离方法，以一株谷氨酸棒状杆菌为出发菌株，得到一株苯丙氨酸和酪氨酸双营养缺陷型的L.色氨酸结构类似物抗性突变株，摇瓶发酵96h后，L-色氨酸积累量达到10.82g/L。

大肠杆菌(Escherichia coli)已经被应用于工业发酵生产各类氨基酸。因此，运用代谢工程手段构建重组大肠杆菌是生产L-色氨酸的有效途径。目前，利用表达质粒介导的氨基酸合成途径和竞争途径中关键性酶基因的过表达或弱化是对大肠杆菌进行基因改造的主要手段。然而利用表达质粒介导基因过表达必将在大肠杆菌细胞内引入抗生素抗性基因并在生长过程中添加一定的抗生素，引起人们对抗生素使用的疑虑。因此，提供一种安全高效的对大肠杆菌进行遗传改造的方法，对于氨基酸生产领域有重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种产L-色氨酸的重组大肠杆菌，替换了莽草酸激酶基因aroK启动子为T7启动子、敲除了色氨酸转运体编码基因mtr和替换了预苯酸脱氢酶编码基因pheA的启动子为tac启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述的tac启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，莽草酸激酶aroK基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，色氨酸转运体编码基因mtr的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，预苯酸脱氢酶编码基因pheA的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，是对大肠杆菌CICC 10303进行基因组编辑得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述基因组编辑是利用CRISPR-Cas9技术进行的。

本发明的第二个目的是提供上述的重组大肠杆菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：

1)构建T7启动子替换重组片段、tac启动子替换重组片段以及敲除mtr基因重组片段：将大肠杆菌莽草酸激酶编码基因aroK基因簇起始密码子上下游同源臂序列融合后，引入T7启动子，得到重组片段T7AROK；将预苯酸脱氢酶编码基因pheA的起始密码子上下游同源臂序列融合后，引入启动子tac，得到片段TACPHE；将色氨酸转运体编码基因mtr上下游同源臂融合，得到片段MTRD。