[发明专利]一种组织工程肌腱微组织的制备方法

说明书

本发明公开一种组织工程肌腱微组织的制备方法，属于生物医药技术领域，旨在构建一种生物源性材料，可在体外与干细胞构建肌腱微组织诱导其向肌腱方向分化，促进肌腱特定蛋白Tenomodulin以及一型和三型胶原的表达，为修复肌腱损伤提供高品质生物材料。该方法的步骤为：将大鼠尾腱取出，反复冻融若干次，在摇床上经过SDS溶液于室温下处理，制备成脱细胞的肌腱细胞外基质；将上述脱细胞的肌腱细胞外基质低温定型，经真空冷冻干燥，获得成型的肌腱细胞外基质；将上述成型的肌腱细胞外基质与P2代大鼠脂肪干细胞共培养若干天，制备出组织工程肌腱微组织。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种组织工程肌腱微组织的制备方法。

背景技术

肌腱是维持关节稳定以及正常运动的重要结缔组织，由于肌腱组织细胞分布和营养血供较少，一旦损伤其自我修复能力较差。如骨性关节炎等，严重甚至影响关节的正常功能。肌腱损伤是骨科的一种常见病，每年在全球范围内有超过3000万肌腱和韧带损伤病例发生，其中大多数与体育相关；然而，用目前的治疗手段很难使损伤的肌腱完全恢复到伤前的状态。因此，如何提高损伤肌腱的愈合效果以及最大限度恢复其正常功能是目前医学面临的一项重大难题。

近些年来，组织工程技术逐渐运用在肌腱修复的领域，其中最关键的部分是选择合适的支架。理想的组织工程支架应该具备两点特性：(1)有较好的生物相容性，能够为种子细胞的生长分化提供一个合适的环境；(2)具备良好的生物力学特性。动物实验和临床研究显示，脱细胞肌腱能够降低组织的免疫源性，使其与宿主以及种子细胞产生良好的生物相容性，用于修复肌腱损伤能在一定程度上恢复肌腱正常功能。此外，细胞外基质(ECM)能为种子细胞提供模拟正常机体的生长微环境，对维持干细胞特性有重要作用。

细胞外基质内含各种细胞因子，它们对跟腱正常生理功能以及病理的愈合起着至关重要的调控作用。在正常组织中，细胞外基质是一个复杂的网状大分子结构，占据着细胞间的空间，主要负责细胞间的信号传导、生长增殖的调控以及力学支撑。据文献报道，肌腱细胞外基质富含大量的基质蛋白，它能促进种子细胞增殖以及向肌腱方向分化，同时维持干细胞表型抑制异位骨化。此外，肌腱细胞外基质源性支架明显增强修复组织的力学性能，同时通过抑制或者激活种子细胞的基质金属蛋白酶(MMPs)来调控肌腱损伤的修复过程。

脂肪间充质干细胞(ADSCs)作为肌腱组织工程的种子细胞，是目前研究最多也是使用最多的种子细胞之一。ADSCs有取材简单，使用方便，对机体损伤小等优点，而且可以通过抽取少量脂肪而获得，它在体外培养过程中可以保持未分化表型在短时间内大量增殖。有研究证明在体外培养过程中，ADSCs未经诱导即具备分泌I型胶原的能力，这与肌腱细胞的功能相像。有研究检测出在普通培养状态下的ADSCs即具备分泌I型胶原的能力，并且在接种后透射电镜显示胞体内含有丰富的粗面内质网，说明在共培养条件下ADSCs仍保持旺盛的分泌功能。因此，ADSCs是肌腱组织工程中一种理想的种子细胞来源。尽管有部分研究者证明可以在体外诱导ADSCs定向分化为肌腱细胞，但是到目前为止，体外培养条件下使ADSCs定向分化为肌腱细胞的技术手段并不成熟。值得注意的是在体外培养的ADSCs移植入体内后，有向肌腱组织分化的倾向，这可能与受体局部微环境中相关的细胞因子的促进与诱导有关。由此可见在肌腱组织工程中，种子细胞的微环境对其生长分化起着决定性的作用。因此我们将脂肪间充质干细胞复合肌腱细胞外基质制备组织工程肌腱微组织，使种子细胞处于模拟肌腱组织的微环境中，促进种子细胞向肌腱方向生长分化，希望能够提高肌腱损伤的修复效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种组织工程肌腱微组织的制备方法，旨在构建一种生物源性材料，可在体外与干细胞构建肌腱微组织诱导其向肌腱方向分化，促进肌腱特定蛋白Tenomodulin以及一型和三型胶原的表达，为修复肌腱损伤提供高品质生物材料。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种组织工程肌腱微组织的制备方法，步骤包括：