[发明专利]一种应用代谢组学技术评价酵母培养物有效物组的方法

权利要求书

1.一种应用代谢组学技术评价酵母培养物有效物组的方法，其特征在于，利用代谢组学的检测技术对酵母培养物有效物组进行解析，并将多变量降维的数学思路运用到挖掘有效物组的组成中,参照筛选解析的有效物组成分，采用化学单品模拟有效物组的构成关系进行配伍组合，再通过动物饲养试验对有效物组的功效进行验证；

所述的代谢组学的检测技术包括样品采集和处理、代谢物的鉴定和多元统计分析；

所述的采用化学单品模拟有效物组的构成关系进行配伍组合具体表现为回归模型的建立与应用，所述的模型建立对生产性能中的日增重指标与筛选到的酵母培养物有效物组之间关系进行研究,利用多元统计分析方法,建立生产性能与酵母培养物有效物组的函数关系，从而进一步揭示有效物组的组合配伍与生产性能的关系；

包括以下步骤：

(1)筛选酵母培养物有效物组

采用单因素完全随机分组设计，选取336羽1日龄健康体重相近的AA爱拔益加肉仔鸡，公母各半随机分为7组，每组6个重复，每个重复8只鸡；试验期为42d；

酵母培养物有效物组筛选分组：对照组饲喂基础日粮，在基础日粮中添加5个时间差异化培养物的酿酒酵母培养物，各处理组添加量为0.192％，以及达农威益康V XP；

DZ为对照组饲喂基础日粮，ABC组为酵母培养物有效物组，即分别饲喂在基础日粮基础上添加有效物组3个配伍组合，D组饲喂发酵24h的酵母培养物24hYC，E、F组为V XP组，在基础日粮基础上分别添加0.1％、1％“V XP”饲料添加剂；整个试验周期饲粮中不添加抗生素与其他促生长剂；

所述的有效物组为甘氨酸、果糖、肌醇、吡喃型半乳糖、蔗糖；试验日粮分配表如下表所示：

试验组	DZ组	A组	B组	C组	D组	E组	F组
基础日粮	√	√	√	√	√	√	√
试验日粮	0对照	配伍1	配伍2	配伍3	24hYC	0.1％V XP	1％V XP

；

ABC组在YC中所占比例配伍情况如下表所示：

各物质配伍说明：取生产性能为发酵24hYC产品的日增重，得到相应的X值，即配伍1有效物组A；在此基础上调整各物质的比例，所述的比例为各物质±10％，配置各物质的含量，为配伍2和3有效物组B、C组；

(2)血清样品采集：采样对象为21日龄和42日龄时，随机选择2只健康和体重相近的鸡；采集到的血清样品于室温放置，待血清析出后将其分装于离心管中，3000r/min离心10min，取其上清分装于Eppendorf试管中，并立即浸入液氮，置-80℃低温保存，用于生化分析用；

器官组织样品采集：采集对象为21日龄和42日龄时，随机选择2只健康和体重相近的试验鸡，采集到的器官组织样品，剔除脂肪后称鲜重并记录，样品保存在-80℃待用；

肌肉样品的采集：于试验第42日结束时每个重复随机选取与该重复平均体重相近的肉鸡2只，采集胸肌和腿肌样品，去除脂肪和结缔组织，称重并记录；

(3)生产性能：试验在21和42日龄时，以重复为单位，分别于试验开始的1、7、14、21、28、35、42d早晨，记录鸡初始重和末重，并记录整个试验期供料量、剩余料量和损失料量，计算平均日采食量ADFI、平均日增重ADG和料重比F/G；

免疫器官指数：在试验的21d和42d，采集免疫器官并称重、记录，器官指数＝器官质量mg/活体质量g；

血清生化指标：使用全自动血液生化分析仪测定血中白蛋白，球蛋白，血清尿素氮与碱性磷酸酶；

血清免疫指标：采集对象为21、42日龄鸡，收集血液，3500r/m，4℃离心10min，取血清于1mL离心管，至于-20℃保存，用于血清总蛋白TP、白蛋白ALB、尿素氮UREA、葡萄糖GLU等测定，检测使用全自动生化分析仪；分泌性免疫球蛋白A IgA、分泌性免疫球蛋白G IgG用ELISA试剂盒南京建成生物工程研究所测定；

血清抗氧化指标：血清中超氧化物歧化酶SOD活性、谷胱甘肽过氧化物酶GPX活性和丙二醛MDA含量使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定；

屠宰性能测定：在试验42d时，每个重复各随机取2只鸡；活体重：禁食12h，测试前后均称重；全净膛重为屠体重去除气管、食道、嗦囊、肠、脾脏、胰腺、胆囊和生殖器官心、肝、肾、腺胃、肌胃、腹脂、头、脚的后的重量；分割左侧胸肌、腿肌并称重，分别为胸肌重和腿肌重；腹脂重主要是腹部板油及肌胃周围的脂肪的重量；计算公式：腹脂率＝腹脂重/全净膛重×100％；胸肌率＝胸肌重/全膛净重×100％腿肌率＝腿肌重/全膛净重×100％；全净膛率＝全膛净重/活体重×100％；

(4)DNA提取

称取21日龄肉鸡的盲肠内容物0.3g于无菌PBS中，涡轮震荡30S后，10000rpm转速下离心10min后取上清溶于DNA缓冲液中；肠道内容物DNA提取方法参照试剂盒QIAamp Fast DNAStool Mini Kit操作步骤QIAGEN，German，样品16S rRNA基因V3-V4区的PCR扩增及Illumina高通量测序由上海派森诺科技股份有限公司完成；

16Sr RNA基因V3～V4区的PCR扩增

将样品DNA稀释至20ng/μL作为模板，扩增细菌16S rRNA V3-4区；使用常规引物338F5′-ACT CCTAC G GGAGGCAGCA-3′和806R 5′-GGA CTAC H VGGGTWTCTAAT-3′，MiSeq测序平台检测；

PCR扩增体系为25μL:5×reaction buffer 5μL,5×GC buffer 5μL,dNTP 2.5mM 2μL，正向引物10μM 1μL,反向引物10μM 1μL，模板DNA 2μL,ddH₂O 8.75μL,Q5 DNA酶0.25μL；PCR扩增条件：98℃预变性2min；然后98℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，25-30个循环；最后72℃延伸5min，10℃保持待测定，PCR扩增产物通过2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，采用AXYGEN公司的凝胶回收试剂盒切胶回收；将PCR扩增回收产物通过荧光试剂为Quant-iTPicoGreen dsDNA Assay Kit进行定量；

高通量测序

采用MiSeq测序仪进行2×300bp的双端测序，相应试剂为MiSeq Reagent Kit V3600cycles；盲肠菌群多样性检测由派森诺生物上海完成；

(5)数据处理与分析：

生产应用试验数据经Excel 2007初步整理后，采用SPSS 23.0统计软件中One-WayANOVA进行方差分析，多重比较采用Duncan's法；P0.05为差异显著，P0.01为差异极显著，数据用“平均数±标准差Mean±SD”表示；

采用Illumina MiSeq平台对群落DNA片段进行双端Paired-end测序；首先对FASTQ格式的双端序列逐一作质量筛查，要求截断后的序列长度≥150bp，且不允许存在模糊碱基；再利用FLASH软件，对通过质量初筛的双端序列进行配对连接；最后，根据样本所对应的Index信息，将连接后的序列识别分配入对应样本，获得样本的有效序列；

运用QIIME软件识别疑问序列，并剔除：5’端引物错配碱基数1的序列；含有连续相同碱基数8的序列；再调用USEARCH检查并剔除嵌合体序列；

Alpha多样性指数：用于比较不同样本的多样性，首先对序列量拉平处理，从而校正测序深度引起的多样性差异；再使用QIIME软件分别对每个样本计算侧重于体现群落丰富度Chao1指数和ACE指数，以及兼顾群落均匀度的Shannon指数和Simpson指数。