[发明专利]一种肌酸激酶同工酶MB的定量检测方法

权利要求书

1.一种肌酸激酶同工酶MB的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)肌酸激酶同工酶MB溶液配制：

1A、肌酸激酶同工酶MB系列校准品的制备：用小牛血清将肌酸激酶同工酶MB抗原梯度稀释成一组校准品，浓度范围为0～300ng/mL；

1B、肌酸激酶同工酶MB抗体包被的磁珠溶液的制备：

方案A：

a1、将1.5μL羧基磁微粒用活化/偶联缓冲液充分清洗3次，在最后一轮洗涤后，将微球重悬于活化/偶联缓冲液中，并确保磁微粒保持分散态；

a2、在室温条件下用去离子水配制200mM EDC和200mM Sulfo-NHS活化试剂；

a3、向每mg洗涤后的磁微粒中快速加入24μL 200mM EDC和240μL 200mMSulfo-NHS；

a4、室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育30分钟后磁吸后去除上清，然后加入活化/偶联缓冲液洗涤微球并充分洗涤3次；

a5、重悬磁微粒后按每mg磁珠加入20～80μg，充分混匀后在室温下用转盘式混合器混合悬液2.5小时，磁吸后去除上清，加入1mL含0.5％牛血清白蛋白的Tris溶液，室温下用转盘式混合器反应0.5小时；

a6、磁吸去上清，用含有0.5％牛血清白蛋白的PBS溶液洗涤3次，并以此最终保存于2～8℃；

方案B：

b1、用PBS缓冲液制备Biotin溶液，将每mg抗体与25μL Biotin溶液室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育30～60分钟，反应完成后取出用脱盐柱进行纯化后2～8℃备用；

b2、用含有0.5％牛血清白蛋白的PBS溶液将1.5μm链霉亲和素磁微粒洗涤三次，在每mg磁微粒中加入20～80μg已处理的抗体，室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育0.5～2小时；

b3、最后用含有0.5％牛血清白蛋白的PBS溶液洗涤三次后加入保存液2～8℃保存。

1C、碱性磷酸酶标记的肌酸激酶同工酶MB抗体溶液的制备：

c1、用PBS缓冲液配制SPDP溶液，在每mg抗体中加入20～50μL SPDP溶液，室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育30～60分钟，反应完成后取出用脱盐柱进行纯化后2～8℃备用；

c2、用PBS缓冲液配制2-IT溶液，在每mg碱性磷酸酶中加入20～50μL 2-IT溶液，室温涡旋震荡后用转盘式混合器孵育30～60分钟，反应完成后取出用脱盐柱进行纯化后2～8℃备用；

c3、经处理后的抗体和碱性磷酸酶等比例混合，室温涡旋震荡后继续用转盘式混合器孵育2小时，反应完成后取出用脱盐柱进行纯化后2～8℃备用；

c4、最后用含有0.5％牛血清白蛋白的PBS溶液进行稀释并于2～8℃保存；

1D、化学发光底物液的制备：AMPPD加入到高PH值的Tris盐酸缓冲液中，加入无机盐和表面活性剂；

1E、清洗液的制备：在Tris盐酸缓冲体系中加入20％氯化钠，2％吐温以及0.2％曲拉通；

(2)微流控肌酸激酶同工酶MB检测芯片及其使用方法：

2A、标准曲线的制作：取10μL心肌肌钙蛋白I梯度校准品，浓度为0，0.05，0.2，1，5，25，100ng/mL，加入到微流控芯片校准品槽中，取50μL试剂加入到对应的试剂槽中，根据配套仪器内部设置的反应过程进行反应，读取光子信息后将由仪器处理并直接获得标准曲线；

2B、微流控肌酸激酶同工酶MB检测芯片操作流程：

b1、注入40微升的全血，全血为男性样本，血溶比为55％，即血浆占比45％、血球占比55％，至全血储存槽(1)，注入12微升带有捕捉抗体的免疫微球至第一试剂储存槽(7)，注入12微升的酶标至第二试剂储存槽(10)；

b2、以5000RPM，加速度为10000RPM/s操控盘式芯片进行旋转55秒钟，已分离的血浆会被保留于血浆/血清储存槽(2)、血球则被保留于血球储存槽(6)，免疫微球带有捕捉抗体、酶标带有侦测抗体，因离心力驱动被传送至混合培育反应槽(16)，并由微流阀门(18)而被保留于混合培育反应槽(16)；

b3、以600RPM，加速度为1000RPM/s操控盘式芯片进行旋转10秒钟，由释放气体储存槽(3)内气体来推动血浆，15微升的血浆可透过血浆/血清传送通道(4)被传送至混合培育反应槽(16)；免疫微球带有捕捉抗体、酶标带有侦测抗体可由微流阀门(18)而被保留于混合培育反应槽(16)；

b4、以1800RPM，加速度为2500RPM/s操控盘式芯片进行顺时针旋转2秒钟后急煞，再以1800RPM，加速度为2500RPM/s操控盘式芯片进行逆时针旋转2秒钟后急煞，由急煞的过程，可扰动混合培育反应槽(16)内液体以达到混合/培育的效果，免疫微球带有捕捉抗体、酶标带有侦测抗体、血浆可藉由微流阀门(18)而被保留于混合培育反应槽(16)；

b5、以250RPM，加速度为1800RPM/s操控盘式芯片进行旋转15秒钟，已完成反应的液体，酶标和血浆会突破微流阀门(18)而被传送至废液槽(19),带有捕捉抗体的免疫微球因微球尺寸小于液体传送通道(17)尺寸，则会被保槽(16)；

b10、以3500RPM加速度为4000RPM/s操控盘式芯片进行旋转5秒钟，已完成反应的55微升的清洗液会突破微流阀门(18)而被传送至废液槽(19),免疫微球因微球尺寸小于液体传送通道(17)尺寸则会被保留于混合培育反应槽(16)。

b11、30微升的发光底物由第三试剂储存槽(12)注入，以1800RPM加速度为2000RPM/s操控盘式芯片进行旋转7秒钟，发光底物透过液体传送通道(14)、液体传送通道(15)而被传送至混合培育反应槽(16)；

b12、以2500RPM加速度为2800RPM/s操控盘式芯片进行顺时针旋转5秒钟后急煞，再以2500RPM加速度为2800RPM/s操控盘式芯片进行逆时针旋转5秒钟后急煞，藉由急煞的过程，可扰动混合培育反应槽(16)内液体以达到混合/培育的效果，免疫微球、发光底物藉由微流阀门(18)而被保留于混合培育反应槽(16)，待反应260秒钟完成后即可进行化学发光侦测。