[发明专利]一种筛选标记自我删除的基因打靶载体及方法

说明书

本发明公开了一种筛选标记自我删除的基因打靶载体及方法，涉及基因修饰技术领域，该基因打靶载体包括如下元件：重组位点1、生殖特异性启动子、重组酶基因、筛选标记启动子、筛选标记基因和重组位点2；其中，生殖特异性启动子选自Prm1基因启动子、Ddx4基因启动子、Stra8基因启动子、AMHR基因启动子或Zp3基因启动子。使用该基因打靶载体修饰目的基因，在制备动物模型的过程中，筛选标记可在F1代自我删除，获得不带筛选标记的F1代，可减少将F1代再与表达重组酶的动物交配以删除筛选标记的步骤，节省了基因打靶去除筛选标记的时间。

技术领域

本发明涉及基因修饰技术领域，具体而言，涉及一种筛选标记自我删除的基因打靶载体及方法。

背景技术

传统的基因打靶是在胚胎干细胞(ES Cell)是进行的，打靶载体与靶基因通过同源重组与靶基因发生片段交换，实现靶基因修饰。这种中靶是极低概率的事件，为了在数十万甚至百万的细胞中富集和筛选出中靶胚胎干细胞，需要在打靶载体上使用Neo,Puro等药物抗性筛选标记，通过药物筛选，可将未整合这类药物抗性筛选标记的细胞杀死，而让携带标记的细胞存活下来。这些药物筛选标记会随胚胎干细胞进入嵌合鼠的基因组，并遗传给后代。有实验表明这些标记的存在会影响中靶小鼠的表型(Colledge et al.,1995；Lantinga-van Leeuwen et al.,2004；Meyers et al.,1998；Olson et al.,1996；van derHoeven et al.,1996)，会影响研究，甚至得出错误的结论。所以，在应用基因打靶模型进行科学研究之前，需要将药物抗性筛选标记去除。

目前，有两种常用的方法可以去除药物筛选标记：1)在中靶胚胎干细胞里面表达重组酶，通过重组酶催化重组位点之间的重组反应删除标记。一方面，需要增加一次电转，在胚胎干细胞中转入表达重组酶的质粒，这个转染操作会对胚胎干细胞的多能性产生影响，进而影响到该细胞注射之后的嵌合能力，以及后期种系遗传(Germline Transmission,GLT)效率；另一方面，也会直接增加时间和人力成本。2)得到成功中靶的小鼠后，将嵌合鼠或F1代杂合子与全身或生殖细胞特异表达重组酶的动物交配，在后代中筛选不带有筛选标记的后代建系，但此方法会同时引入重组酶表达基因，可能给研究带来影响，通常在获得筛选标记删除成功的后代以后，还需要再繁育一代，分离出不携带重组酶的后代才能建系用于实验。因此，也会大大增加时间和人力成本。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种筛选标记自我删除的基因打靶载体，使用该基因打靶载体修饰目的基因，在制备动物模型的过程中，筛选标记可在F1代自我删除，获得不带筛选标记的F1代，可减少将F1代再与表达重组酶的动物交配以删除筛选标记的步骤，节省了基因打靶去除筛选标记的时间。

本发明的目的在于提供一种构建基因修饰动物模型的方法，采用该方法构建基因修饰动物模型，在制备动物模型的过程中，筛选标记可在F1代自我删除，获得不带筛选标记的F1代，可减少将F1代再与表达重组酶的动物交配以删除筛选标记的步骤，节省了基因打靶去除筛选标记的时间。

本发明是这样实现的：

一种筛选标记自我删除的基因打靶载体，其包括如下元件：重组位点1、生殖特异性启动子、重组酶基因、筛选标记启动子、筛选标记基因和重组位点2；

其中，生殖特异性启动子选自Prm1基因启动子、Ddx4基因启动子、Stra8基因启动子、AMHR基因启动子或Zp3基因启动子。

本发明使用的启动子包含了较完整的转录因子识别位点，以及部分上游序列，比截短的启动子相比，可更有效地实现生殖细胞特异性的转录。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，Prm1基因启动子的序列如SEQ ID NO.9所示。