[发明专利]一种胎盘间充质干细胞的分离方法

权利要求书

1.一种胎盘间充质干细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取离心管，在垂直于离心管轴线的平面上放置一片滤板，使滤板下方的离心管容积占离心管总容积的20～40％，所述滤板的中心位置设置一个用于加液的圆孔，所述圆孔的直径为0.45～0.75cm；所述滤板还设置若干个相互平行的条形筛条，每两个相邻筛条之间形成长方形筛孔，所述筛孔的宽为0.15～0.25cm；

(2)通过步骤(1)所述圆孔向离心管中加入细胞分离液，所述细胞分离液的添加量以没过滤板为标准；

(3)将新鲜的胎盘组织消化液加入到离心管中，1000～2000rpm离心10～30min，实现组织消化液的分层；

(4)倒掉滤板上层消化液，穿过圆孔吸取滤板下的含有胎盘间充质干细胞的细胞分离液。

2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤(2)中细胞分离液为添加有5～15％体积含量胎牛血清和20～60g/L葡聚糖的DMEM培养基。

3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤(3)中胎盘组织消化液的制备方法包括如下步骤：

①将胎盘组织置于质量体积比为0.1～0.3％g/ml的胰蛋白酶溶液中，预消化10～20min，得到预消化后的胎盘组织；

②将所述预消化后的胎盘组织剪碎，得到单个体积为1～2mm³的肉糜；

③将所述肉糜与胎盘消化液按照1:4～8的体积比混合，36～38℃消化20～40min，得到胎盘组织消化液。

4.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，所述步骤①胎盘组织为经病毒检测合格的绒毛膜组织或者底蜕膜组织。

5.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，所述步骤①胎盘组织在预消化前，还包括清洗，所述清洗用试剂为含有80～250kU/L青霉素和80～250kU/L链霉素的PBS缓冲液。

6.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，所述步骤③中胎盘消化液为添加有质量体积比为0.1～0.3％g/ml的胰蛋白酶和质量体积比为0.2～0.4％g/ml胶原蛋白酶的PBS缓冲液。

7.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤(4)得到含有胎盘间充质干细胞的细胞分离液后，培养所述胎盘间充质干细胞。

8.根据权利要求7所述的分离方法，其特征在于，所述培养前包括离心分离的步骤，所述离心分离的离心力为500～700g，时间为5～15min。

9.根据权利要求7所述的分离方法，其特征在于，所述培养开始后36～60h全量换液，继续培养，所述继续培养每2～4天进行半量换液。

10.根据权利要求7所述的分离方法，其特征在于，当细胞融合度达到90％时，进行细胞的成软骨、成骨和成脂肪诱导。