[发明专利]一种胎盘间充质干细胞的分离方法

说明书

本发明提供了一种胎盘间充质干细胞的分离方法，属于生物技术领域。本发明先取离心管，在垂直于离心管轴线的平面上放置一片滤板，使滤板下方的离心管容积占离心管总容积的20～40％，滤板中心位置设置圆孔；滤板还设置若干个相互平行的条形筛条，每两个相邻筛条之间形成长方形筛孔；然后通过圆孔向离心管中加入细胞分离液至液面没过滤板；再将新鲜的胎盘组织消化液加入到离心管中，1000～2000rpm离心10～30min；最后倒掉滤板上层消化液，用吸管穿过圆孔，吸取得到含有胎盘间充质干细胞的细胞分离液。本发明提供的方法不用中和胰酶，不须用100um细胞筛网过滤，操作简单、快速，能提高干细胞产量和活力。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种胎盘间充质干细胞的分离方法。

背景技术

干细胞是人体内一类能够自我更新分化的细胞，其来源广泛，分化潜能多样，具有多种生理效应。随着人们对干细胞的鉴定和认识，其逐渐受到临床应用的青睐，在治疗疾病、提高病人生存质量上已取得显著成效。干细胞的应用是一个转化医学的问题，其应用主要涉及细胞治疗、细胞美容、细胞诊断以及干细胞相关副产品的开发。

间充质干细胞是干细胞中来源最广的一类细胞，其来源主要有胎盘、脐带、骨髓和脂肪。胎盘和脐带是生育后的无用组织，在组织采集过程对人体没有创伤，其组织内的间充质干细胞没有随成人生长接触过多的不利因素，获取到的间充质干细胞更加安全，因此胎盘和脐带是间充干细胞的理想来源。近几年来，间充质干细胞的安全性和有效性在临床中得到了证实。国际上已有间充质干细胞药物成功上市，实现了传统化学药物向现代化细胞药物的转变。

如何安全有效的分离间充干细胞，是干细胞产品质量和产业化的保障。在现有的技术体系中，胎盘间充质干细胞的分离方法主要两大类：胰酶消化法和灌注法。

酶消化法，是将胎盘组织剪成碎块后，用胰蛋白酶或胶原酶消化1-2小时，用含胎牛血清的培养基终止酶消化，然后洗涤细胞弃去消化酶，将洗涤后的细胞接种至培养器皿中进行培养扩增。该方法在组织剪切和消化过程中会破坏大量细胞，释放大量染色体，导致消化液非常粘稠。在细胞培养环境中如果含有大量DNA，将干扰细胞的贴壁和生长。因此，一般需要使用100um孔径的细胞筛网过滤消化液，细胞过滤需要1～2小时。细胞筛网过滤消化液的操作时间过长，容易导致获得的细胞活力低、增殖慢。另外，因为消化液非常粘稠，其在过滤的过程中也极易阻塞细胞筛网。

灌流法是利用胎盘特殊的解剖结构，用灌流液孵育胎盘，从灌流液中分离单个核细胞，洗涤后再用间充质干细胞培养基悬浮所获细胞，进行培养。该方法从胎盘组织中提取间充质干细胞，由于胎盘中血液含量多，冲洗时消耗的试剂量极大，且血液难以彻底冲洗。

发明内容

有鉴于背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种胎盘间充质干细胞的分离方法，获得的胎盘干细胞活性高，红细胞含量少，为胎盘干细胞的临床应用以及产业化提供保障。

本发明提供了一种胎盘间充质干细胞的分离方法，包括如下步骤：

(1)取离心管，在垂直于离心管轴线的平面上放置一片滤板，使滤板下方的离心管容积占离心管总容积的20～40％，所述滤板的中心位置设置一个用于加液的圆孔，所述圆孔的直径为0.45～0.75cm；所述滤板还设置若干个相互平行的条形筛条，每两个相邻筛条之间形成长方形筛孔，所述筛孔的宽为0.15～0.25cm；

(2)通过步骤(1)所述圆孔向离心管中加入细胞分离液，所述细胞分离液的添加量以没过滤板为标准；

(3)将新鲜的胎盘组织消化液加入到离心管中，1000～2000rpm离心10～30min，实现组织消化液的分层；

(4)倒掉滤板上层消化液，穿过圆孔吸取滤板下的含有胎盘间充质干细胞的细胞分离液。

优选的，所述步骤(2)中细胞分离液为添加有5～15％体积含量胎牛血清和20～60g/L葡聚糖的DMEM培养基。