[发明专利]链霉亲和素和高斯荧光素酶的融合蛋白及其应用

说明书

一种链霉亲和素和高斯荧光素酶的融合蛋白及其应用，该融合蛋白包括链霉亲和素全长蛋白和高斯荧光素酶全长蛋白或持续发光突变体，链霉亲和素全长蛋白与高斯荧光素酶全长蛋白或持续发光突变体通过柔性肽连接。本发明的融合蛋白能够方便、特异性地识别生物素分子，并具有催化底物氧化发光的功能，便于检测。相对于现有技术中的高斯荧光素酶与链霉亲和素的偶联蛋白，本发明的融合蛋白具有工艺简单，便于生产的优点。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种链霉亲和素和高斯荧光素酶的融合蛋白及其应用。

背景技术

链霉亲和素(streptavidin,SA)是Chaiet在1963年发现的，是Streptomycesavidinii菌在培养过程中分泌的产物。一条SA肽链中有159个氨基酸残基，分子量为16.5kDa。完整的SA蛋白由4条SA多肽链组成，形成一个四聚体结构。每条多肽链都可以特异性地结合一个生物素(Biotin)分子，因此，1分子SA可以结合4分子的生物素。两者之间的相互作用以非共价结合形式存在，亲和力达到10^-15/M，比抗原抗体的结合常数高若干数量级，是自然界中存在的最稳定的蛋白与小分子间相互作用。两者之间的强结合导致生物素和SA经常被用于开发标记和检测的工具。应用时通常将生物素标记于待检测的底物，用SA结合于标记在底物上的生物素，再用SA的抗体结合于SA，同时抗体上预先连接有发光基团，可被激发发光，最终通过检测发光而检测到底物。

荧光素酶是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。通常发现于低等动物体内。目前常用的荧光素酶有萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶及高斯荧光素酶。萤火虫荧光素酶发光需要ATP和Mg²⁺的辅助，海肾荧光素酶虽然不依赖于ATP和Mg²⁺等辅助因子，但发光强度较弱，应用时需要更灵敏的检测。

高斯荧光素酶(gaussia luciferase,Gluc)很好地弥补了萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的缺点，发光时既不需要ATP和Mg²⁺等辅助因子，也有高于海肾荧光素酶100倍的发光效率。高斯荧光素酶是由一种海洋挠趾类动物分泌的荧光素酶，是目前发现的分子量最小的荧光素酶，并且具有信号肽，可以分泌到胞外，便于活性检测。在氧气存在的条件下，高斯荧光素酶可自发催化底物腔肠素氧化发光。发光强度是目前发现的荧光素酶中最高的，易于检测。由于以上优点，高斯荧光素酶在活细胞检测、蛋白与蛋白相互作用、蛋白定位、小干扰RNA沉默技术、高通量药物筛选等领域中得到了广泛的应用。

目前对生物素的识别检测，主要有两种方法：一种是SA和anti-SA抗体联用，一种是用SA和高斯荧光素酶的偶联。对于SA和anti-SA抗体联用，主要是用SA特异性识别生物素，然后用带有发光基团的anti-SA抗体识别SA，最终通过检测抗体上的发光基团的发光来检测生物素。这种方法过程繁琐，耗时长。SA和高斯荧光素酶的偶联蛋白，是在高斯荧光素酶分子上通过化学偶联修饰上一个生物素，再以1：1的比例加入SA，SA与高斯荧光素酶上的生物素结合形成一个偶联蛋白，最终通过分子筛纯化将结合比例为1：1的偶联蛋白纯化。该蛋白可特异性结合SA，并且具有自发光的能力，便于检测。但该偶联蛋白制备过程繁琐，工艺复杂，生产效率低下，不利于扩大产量，同时1分子SA上只有1分子发光蛋白，不具备信号放大功能。

发明内容

本发明提供一种链霉亲和素和高斯荧光素酶的融合蛋白及其应用，该融合蛋白只需一次表达纯化即可得到，生产工艺简单，有利于规模生产。

根据第一方面，一种实施例中提供一种链霉亲和素和高斯荧光素酶的融合蛋白，该融合蛋白包括链霉亲和素全长蛋白和高斯荧光素酶全长蛋白或持续发光突变体，上述链霉亲和素全长蛋白与上述高斯荧光素酶全长蛋白或持续发光突变体通过柔性肽连接。

在优选实施例中，上述链霉亲和素全长蛋白如SEQ ID NO：1所示。

在优选实施例中，上述高斯荧光素酶全长蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。