[发明专利]线粒体mt3243AG突变人群的尿液中分离培养正常的干细胞的制备方法和应用

权利要求书

1.线粒体mt3243AG突变人群的尿液中分离培养正常的干细胞的制备方法和应用，其特征在于：包括以下步骤：

S1:干细胞提取；

S2:干细胞培养；

S3:干细胞实验。

2.根据权利要求1所述的线粒体mt3243AG突变人群的尿液中分离培养正常的干细胞的制备方法和应用，其特征在于：所述S1步骤是指将三抗加入T75瓶中，并将T75瓶子喷上消毒水，进行尿液采集，然后从200ml患者尿液中提取出尿液干细胞，并采用0.1-1％明胶包被过的96孔培养板进行培养，明胶包被96孔板，放入孵箱。

3.根据权利要求1所述的线粒体mt3243AG突变人群的尿液中分离培养正常的干细胞的制备方法和应用，其特征在于：所述S2步骤是指将尿液转移到4支50ml离心管内，密封后，离心样本，转速为1500/10min,离心完成后，将细胞转移到15ml～20ml PBS内，吹打混匀，再次离心，转速为1500/10min。尿液干细胞培养基重悬细胞，接种至96孔板进行培养，第3天或第4天半量加液，第5或第6天半量换液，第10天左右将出现成单克隆集簇的细胞团，当细胞密集程度达80％～90％时进行消化传代，传代为P1代，后续细胞培养每2～3天换液，待细胞达80％～90％融合时进行正常传代。

焦磷酸测序：96孔板，每孔各加70uL binding buffer mix,各孔对应PCR产物10uL，振荡器打开，25℃，1300rpm震荡15Min，加入引物和缓冲液，24孔圆板置于振荡器，80℃，5min，0rpm。记录A>G的突变率；

成骨分化：将细胞置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养，当细胞融合度达到60％-70％时，小心的将孔内完全培养基吸走，向六孔板中加入2mL成人骨髓间质干细胞成骨诱导分化完全培养基(Cyagen,HUXMA-90021)，每2～3天换用新鲜的成人骨髓间质干细胞成骨诱导分化完全培养基(使用前需预热至37℃),诱导2-4周后，视细胞的形态变化及生长情况，用茜素红进行染色并进行相关实验；

成脂分化：将细胞置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养，当细胞融合度达到100％或者过融合，小心地将间质干细胞完全培养基吸走，向六孔板中加入2mL成人骨髓间质干细胞成脂诱导分化培养基(Cyagen,HUXMA-90031)A液，诱导3天后，吸走六孔板中的A液，加入2mL成人骨髓间质干细胞成脂诱导分化培养基B液，24h后，吸走B液，换回A液进行诱导，A液和B液交替作用3-5次后(交替次数视分化情况而定)，继续用B液维持培养4-7天直到脂滴变得足够大、圆，B液维持培养期间，每隔2-3天需要换用新鲜的B液。

4.根据权利要求1所述的线粒体mt3243AG突变人群的尿液中分离培养正常的干细胞的制备方法和应用，其特征在于：所述S3步骤是指根据S2步骤的干细胞培养情况，视细胞的形态变化及分化情况，进行线粒体功能检测、分化能力等相关实验。