[发明专利]线粒体mt3243AG突变人群的尿液中分离培养正常的干细胞的制备方法和应用

说明书

本发明属于医疗技术技术领域，尤其为线粒体mt3243AG突变人群的尿液中分离培养正常的干细胞的制备方法和应用，其特征在于：包括以下步骤：S1:干细胞提取；S2:干细胞培养；S3:干细胞实验；本发明的优点在于它可以无创获取，并且无论患者的性别，年龄和健康状况都可以获取。而且它作为原代细胞，保有原有细胞的基本性质，从突变患者的尿液中分离提取出干细胞，通过细胞单克隆分离出无突变的尿液干细胞，具有分化为无突变的正常成骨细胞和正常脂肪细胞的潜能，为患者进行自体干细胞治疗提供了理论依据和技术支持。

技术领域

本发明属于医疗技术领域，具体涉及线粒体mt3243AG突变人群的尿液中分离培养正常的干细胞的制备方法和应用。

背景技术

干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”，间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，间充质干细胞临床应用于解决多种血液系统疾病，心血管疾病，肝硬化，神经系统疾病，膝关节半月板部分切除损伤修复，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，自体尿液来源的干细胞是一种新型的间充质干细胞，具有取材容易，无创，供应充足可反复取材，且没有伦理上的争议。

线粒体基因tRNALeu(UUR)A3243G突变(以下简称tRNALeu(UUR)A3243G 突变)糖尿病是一种以糖尿病伴神经性耳聋为主要临床表现的母系遗传单基因突变糖尿病，该疾病是由于编码线粒体亮氨酸tRNA基因——tRNALeu(UUR) 发生突变、即线粒体DNA第3243位核苷酸序位发生A→G突变所致， tRNALeu(UUR)A3243G突变容易累及ATP阈值高的组织，主要临床特点表现为： 40岁以前起病的早发糖尿病，患者多消瘦，病程中胰岛功能进行性衰退，糖尿病确诊后2年内常需改用胰岛素治疗，其病理生理机制是胰岛β细胞线粒体功能损害致胰岛素分泌不足，超过75％患者有感觉神经性耳聋，亦可伴有神经系统、眼、骨骼肌、心脏及肾脏等病变，

且病变呈母系遗传，患者的外周血和尿液具有杂胞质性的特征，即突变细胞和正常细胞在不同组织中共同存在且比例不同。

尿液源的干细胞也存在这个问题，目前人工修饰线粒体tRNALeu(UUR)A3243G仍然十分困难，还没有很好的手段对突变基因进行编辑，因此如何从突变患者中分离出正常的尿液间充质干细胞是目前该类患者的难题，也是未来治疗的方向。

在有线粒体DNA突变的组织细胞内，有的线粒体环内含突变型基因，有的线粒体环内含野生型基因。这两种线粒体环在组织细胞内混杂存在，即为杂胞质性。同一种组织细胞之间的杂胞质程度可不一致，即细胞之间含突变型线粒体环的数量比例可不一致。此见于一个个体的各个卵细胞之间，亦见于受精卵分化发育成的各种组织细胞间，因此，同一种基因突变在不同个体中就可因这种组织细胞杂胞质性，致不同组织细胞的突变线粒体负荷有很大差异，以致个体间可能呈现迥然相异的临床表现。在患者的尿液干中同样存在这个问题，因此如何用患者自身的尿液干细胞进行治疗有很大的困难。

发明内容

为解决上述背景技术中提出的问题。本发明提供了线粒体mt3243AG突变人群的尿液中分离培养正常的干细胞的制备方法和应用，具有无创获取和不限制患者性别、年龄和健康状况的特点。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：1.线粒体mt3243AG突变人群的尿液中分离培养正常的干细胞的制备方法和应用，其特征在于：包括以下步骤：

S1:干细胞提取；

S2:干细胞培养；

S3:干细胞实验。

优选的，所述S1步骤是指将三抗加入T75瓶中，并将T75瓶子喷上消毒水，进行尿液采集，然后从200ml患者尿液中提取出尿液干细胞，并采用0.1-1％明胶包被过的96孔培养板进行培养，明胶包被96孔板，放入孵箱。