[发明专利]一种转录组建库的方法、试剂和应用

说明书

本申请公开了一种转录组建库的方法、试剂和应用。本申请的转录组建库方法包括，采用带U碱基的引物对cDNA进行PCR扩增，然后对扩增产物进行酶切将U碱基消化去除，制备具有黏性末端的PCR扩增产物，利用所制备的黏性末端，与含有互补黏性末端的接头互补连接，即获得转录组文库。本申请的转录组建库方法，在cDNA的PCR扩增引物中引入U碱基，通过一组酶先进行U碱基酶切，产生黏性末端，再利用酶切得到的黏性末端与接头连接，此过程在一管中一步完成；减少了Pacbio全长转录组建库步骤和操作环节，缩短了建库时间，并降低建库成本。

技术领域

本申请涉及转录组基因测序领域，特别是涉及一种转录组建库的方法、试剂和应用。

背景技术

基因组和转录组测序是生命科学领域的基础性工作。由于绝大部分非模式生物缺乏基因组数据，全长转录组测序就变得尤为重要，全长转录本可以大大促进这些物种的基因功能、基因表达调控和进化关系等多方面的基础与应用研究。当前，绝大多数的转录组数据都是基于第二代高通量测序技术获得的。然而，第二代测序技术测序序列短，短序列拼接无法提供大量的长转录本并且丢失了可变剪接等重要信息，因而转录组的从头测序开始采用PacBio第三代测序技术。在2013年PacBioRSII推出时，其通量较低，测序成本一直让科研人员望而止步。到2015年10月，PacBio推出Sequel平台，大幅提升了全长转录组的测序通量，在通量上是PacBioRSII的5-10倍。鉴于三代测序技术在科研甚至临床领域的发展潜力，很多公司相继引入Sequel平台，提供Pacbio三代测序的全长转录组测序服务。

目前Pacbio三代测序的全长转录组按照Pacbio公司推出的标准方案来进行，过程如图1所示，主要包括两个方面：cDNA的制备和转录组建库。其中，cDNA的制备包括使用Clontech公司的SMARTerPCRcDNASynthesisKit试剂盒，将RNA反转录生成cDNA。转录组建库，如图1和图2所示，包括对cDNA进行PCR，PCR产物经过DNA损伤修复、末端修复、磁珠纯化、接头连接、酶消化去除不完整文库、磁珠纯化共六个步骤，获得可以用于后续测序的转录组测序文库；这六个步骤至少需要在三个反应管中进行总计约3h的反应。

总的来说，现有的转录组建库方法过程复杂、建库时间长、成本高，不利于全长转录组的广泛深入研究和应用。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的转录组建库的方法、试剂和应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种转录组建库的方法，包括采用带U碱基的引物对cDNA进行PCR扩增，然后对扩增产物进行酶切将U碱基消化去除，制备具有黏性末端的PCR扩增产物，利用所制备的黏性末端，与含有互补黏性末端的接头互补连接，即获得转录组文库。其中，含有互补黏性末端的接头是指，该接头上带有互补黏性末端的序列，即能够与U碱基消化后产生的黏性末端互补匹配，从而将接头连接到PCR扩增产物上。

需要说明的是，本申请的转录组建库方法，其关键在于采用带U碱基的引物进行cDNA的PCR扩增，至于前期的cDNA制备，以及后续的互补连接后的酶消化去除不完整文库等步骤与现有的建库方法相同。本申请的转录组建库方法，由于采用带U碱基的引物进行cDNA的PCR扩增，使得U碱基消化去除、接头连接可以在一个反应管中一步完成，包括后续的酶消化去除不完整文库和纯化，整个建库流程除RT-PCR以外，只需要三个步骤，并且三个步骤无需转换反应管，在一个反应管中即可先后完成，反应时间总计约1.5h，如图3所示；与现有的转录组建库需要在三个反应管中进行总计约3h的六个步骤的反应相比，本申请的转录组建库方法不仅缩减了建库流程，缩短了建库时间，提高了建库效率，而且相应的减小了建库的试剂和时间成本。